В 60-х годах прошлого века,
молекулярно-биологические методы исследования стали применяться практически во
всех важнейших отраслях биологии. Методом, сыгравшим существенную роль в
классификации вида Yersinia pestis, а, следовательно,
в выборе диагностических тестов, стал метод гибридизации нуклеиновых кислот, который
позволил говорить о высокой степени родства у различных представителей рода Yersinia [1].
В 80-х годах 20 века у ряда возбудителей рода
Yersinia были обнаружены
видоспецифические последовательности ДНК эписомной природы [2,6,8]. Выделенные
плазмиды сразу же стали дополнительным маркером для детекции возбудителя чумы и
характеристики штаммов, выделенных из различных природных очагов. Был введен и
закрепился термин «плазмидовар», отражающий группу штаммов с определенным
плазмидным профилем. Некоторые природные очаги характеризовались тем, что в них
циркулировали штаммы с необычным набором плазмид, к тому же обладающих
измененной молекулярной массой или имеющих в своём составе различные
дополнительные криптические плазмиды в отличие от типичного набора: pYP/6 МД - пестициногенность (Рst) и синтез плазмокоагулазы (Рlа); pYV/47
МД - белки внешних мембран (Уор) и Са2+-зависимость (Саd), pYT/65
МД – синтез видоспецифического капсульного антигена F1 (Frа
/Саf1) и «мышиного» токсина
(Тох/Мur). Возбудителя
псевдотуберкулёза от этих штаммов отличало отсутствие 6МД и 65МД, и преобладание штаммов с плазмидами 45-50 МД
и 83 МД. Набор плазмид у выделенных штаммов помогал исследователям в
классификации штаммов, но не позволял проводить детекцию атипичных штаммов, у
которых отсутствовали плазмиды, либо присутствовали, например, только
родоспецифические плазмиды.
Поиск новых подходов привел к разработке
метода молекулярного зондирования. Авторы предлагали для лабораторного анализа
короткие последовательности ДНК, специфичные для конкретного микроорганизма,
меченные радиоактивным фосфором и способные гибридизоваться только с таким же
фрагментом ДНК этого микроорганизма. В первых работах в этом направлении
предлагались в основном зонды на основе последовательностей плазмидной ДНК
возбудителя чумы, которые отсутствовали у возбудителя псевдотуберкулеза. Речь
идет о зондах, сконструированных на основе гена активатора плазминогена - pla и генов 65 MД плазмиды. Предложенные зонды выявляли
полноценные штаммы возбудителя чумы и дифференцировали их от штаммов
Y.pseudotuberculosis. Вероятность отрицательного результата детекции
возбудителя чумы сохранялась из-за того, что некоторые штаммы этого вида не
содержали той или иной плазмиды. Частично эту проблему предложили решить с
помощью комбинированного использования, имеющихся в наличии зондов. Однако и в
этом случае атипичные штаммы чумного микроба, совсем не содержащие плазмид, не детектировались.
Необходимо было искать специфические последовательности
на основе хромосомной ДНК. Первые сконструированые зонды для гибридизации на
основе хромосомных генов были в основном родоспецифичными [5]. Один из зондов,
предложенный на основе recA
гена, оказался пригодным для детекции трёх основных представителей рода
Yersinia. С его помощью обнаруживали
100% штаммов Y.pestis, 96% штаммов Y.pseudotuberculosis и 85%
штаммов Y.enterocolitica. В 1991 году были идентифицированы два
фрагмента хромосомной ДНК, которые гибридизовались как с ДНК Y.pestis так и Y.pseudotuberculosis,
хотя в более жёстких условиях (78оС)
гибридизация одного из них имела место только с ДНК возбудителя чумы. В дальнейшем
оказалось, что выделенный фрагмент был частью IS100 элемента. Последовательность этого
элемента предлагалась для детекции возбудителя чумы и другими авторами [3].
Однако по их результатам одинаково эффективно выявлялись штаммы Y.pestis и
Y.pseudotuberculosis I
серотипа. В 1998 году группой авторов из Германии была опубликована работа, в
которой представлены данные сравнения последовательностей ДНК рибосомных генов,
кодирующих 16S и 23S РНК у различных представителей рода Yersinia [4]. На основании результатов анализа генов
16S и 23S РНК различных иерсиний авторы сконструировали
гибридизационные зонды, способные детектировать отдельно штаммы Y.
enterocolitica и Y. pseudotuberculosis, вместе - Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, и «родовой» зонд, позволявший детектировать
все три вида иерсиний (включая Y.enterocolitica). Комбинация четырех зондов
позволяла с успехом дифференцировать Y.pseudotuberculosis и Y.pestis. Предложенная методика была эффективна для детекции отдельных
представителей Yersinia, но сложна для выполнения в условиях обычной практической лаборатории.
С течением времени стали шире применяться
новые методы лабораторной диагностики, в частности, полимеразная цепная реакция
(ПЦР), которая оказалась эффективной и в детекции возбудителя чумы, находящегося в «некультивируемой» форме. Для
постановки ПЦР сконструирован ряд праймеров, позволяющих дифференцировать
возбудитель чумы от других микроорганизмов. В их число вошли праймеры, на
основе плазмидных последовательностей, таких как рla ген активатора
плазминогена, ген yop1,
ген caf1 и ген, кодирующий
«мышиный» токсин. С учётом необходимости выделения атипичных штаммов Y.pestis, у которых отсутствуют отдельные видоспецифические плазмиды, было
предложено использовать в ПЦР для детекции возбудителя чумы одновременно три
пары праймеров, комплементарных последовательностям всех трёх основных плазмид.
Иными словами, использовался тот же алгоритм действий, что и для радиоактивных
зондов. К сожалению, штаммы возбудителя чумы, не содержащие в своем составе
всех плазмид, по-прежнему не выявлялись в предложенных тестах. Следовательно, и
этот более совершенный метод исследования не устранял проблему гарантированной
детекции всех, в том числе и атипичных, вариантов возбудителя чумы.
Только в последние годы было предложено
решение задачи детекции всех вариантов Y.pestis в одном тесте простым и эффективным методом со специфическими
хромосомными праймерами в ПЦР. С помощью метода “suppression subtractive hybridization”, основанного на «вычитании» гомологичных
секвенсов, удалось выявить 41,7 kb
регион, существующий в хромосоме Y.pestis, а у Y.pseudotuberculosis замененный на
другую последовательность. Четыре пары праймеров, направляющие синтез четырех
участков этого региона, детектировали все использованные штаммы Y.pestis и не выявляли штаммы Y.pseudotuberculosis. Детекция возбудителя
псевдотуберкулеза оказалась возможной с помощью других праймеров, направляющих
синтез участка ДНК, который находится в хромосоме Y.pseudotuberculosis вместо 41,7 kb региона возбудителя чумы.
Судя по данным литературы, специалистам
удалось разработать эффективные и быстрые методы детекции представителей рода
Yersinia и, в частности, одного из наиболее опасных микроорганизмов -
возбудителя чумы.
Литература:
1.
Adair D.M., Worsham P.L., Hill K.K. et al. // J. Clin.
Microbiol. - 2000. - V. 38, N. 4. - P. 1516-1519.
2. Ferber D.M.,
Brubaker R.R. // Infect. and Immun.. -
1981. – V. 31. – P.839-841
3. Podladchikova
O.N., Dikhanov G.G., Rakin A.V. et al. // FEMS
Microbiol. Lett. - 1994. - V.121. - P. 269-274.
4. Trebesius
K., Harmsen D., Rakin A. et al. // J. Clin. Microbiol.-1998. – V. 36, N.9. – P.
2557-2564.
5. Диханов Г.Г., Подладчикова О.Н. // Мол.
биология. - 1990. - T. 24,
№ 3. -C. 1010-1016.
6. Мишанькин Б.Н., Сучков И.Ю. // Мат. Науч.
практ. конф. посв. 100 лет. образов. противочумной службы России. - Саратов. –
1997. – Т. 2. – С. 89-90.
7. Подладчикова О.Н., Диханов Г.Г., Мишанькин
Б.Н. // Состояние, пробл. и перспект. диагн. бактер. инф.: Матер. раб. совещ. –
Оболенск, 1990. - С. 77.
8. Попов Ю.А., Федотов Э.А. Кокушкин А.М. и др.
// Журн. микробиол., эпидемиол., иммунол. -1994. -№ 5. – С.