ОПТИМИЗАЦИЯ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ПРОДУКЦИИ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ШТАММОМ  ESCHERICHIA COLI CPG-KH11

Коровашкина А.С., Радевич Д.С.*, к.б.н. Квач С.В.,

д.б.н. Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

*Международный государственный экологический университет

имени А.Д. Сахарова, Минск

Оптимизация состава питательной среды для продукции плазмидной ДНК штаммом

Escherichia coli CpG-KH11

CpG-мотивы представляют собой особые шестичленные нуклеотидные последовательности, содержащие в своей центральной части CpG-динуклеотид. В ДНК бактерий преобладают неметилированные CpG-мотивы. В геноме позвоночных CpG-динуклеотиды встречаются в 3–4 раза реже, чем у бактерий, кроме того, около 70–80% CpG-мотивов ДНК позвоночных метилированы по пятому атому углерода остатка цитозина [1].

Неметелированные CpG-мотивы взаимодействуют с TLR9-рецепторами иммунокомпетентных клеток (В-клетки, макрофаги, дендритные клетки и др.) и стимулируют врожденный неспецифический иммунитет человека и животных [2]. Благодаря своим иммуностимулирующим свойствам, ДНК, содержащая CpG-мотивы, может быть использована для лечения и профилактики таких заболеваний как астма, аллергия, некоторые виды опухолей, бактериальные и вирусные инфекции и др., а также в качестве адъюванта для ряда вакцин [3].

Наиболее перспективным способом получения СpG-ДНК является создание плазмид, обогащенных CpG-мотивами, с последующей наработкой в бактериальных клетках. Из литературных источников известно, что состав питательной среды и условия культивирования в значительной степени влияют на скорость роста бактерий, а также на копийность и стабильность плазмидной ДНК (пДНК) [4]. Использование минимальных питательных сред, содержащих известное количество необходимых питательных компонентов, позволит повысить экономическую эффективность процесса получения плазмид, обогащенных CpG-мотивами.

Цель настоящей работы состояла в подборе компонентов минимальной питательной среды, обеспечивающей высокий выход целевой пДНК.

Объекты и методы исследования. В работе использован штамм Escherichia coli CpG-KH11, хранящийся в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов Института микробиологии НАН Беларуси под номером БИМ В-670Д. Данный штамм сконструирован ранее [5] на основе штамма E. coli BLR(DE3) (Novagen, США) и содержит плазмиду pCpG-KH11, имеющую в своем составе 96 повторов CpG-мотива GTCGTT, который, по литературным данным, наиболее эффективно стимулирует иммунную систему человека. Для культивирования бактерий в качестве исходной использовали среду следующего состава: 0,5% глицерин, 0,05% глюкоза, 0,05% изолейцин, 2 мМ MgCl₂, 25 мМ Na₂HPO₄, 25 мМ KH₂PO₄, 50 мМ NH₄Cl, 5 мМ Na₂SO₄ (pH 7,0) с добавлением ампициллина до конечной концентрации 150 мкг/мл. Клетки E. coli CpG-KH11 выращивали в колбах Эрленмейера объёмом 250 мл, содержащих по 30 мл питательной среды, на биологической качалке с частотой колебания платформы 170–190 об/мин при 37^оС в течение 16 ч. Для определения продуктивности штамма в отношении плазмиды pCpG-KH11 из полученной биомассы выделяли плазмиду стандартным методом щелочного лизиса [6].

Результаты и обсуждение. Для подбора состава минимальной среды, позволяющей получать высокие выходы пДНК, обогащенной иммуностимулирующими CpG-мотивами, изучали влияние основных компонентов питательной среды, таких как источник углерода, азота, концентрация солей и микроэлементов, на выход целевого продукта.

Углерод – основной источник энергии в питательных средах. Для подбора источника углерода, позволяющего получать наибольший выход пДНК, в качестве основного источника углерода в питательную среду вносили глюкозу, глицерин, сукцинат натрия, цитрат калия или сахарозу до конечной концентрации 0,5%. Результаты эксперимента представлены в таблице 1.

Таблица 1

Влияние источников углерода на продукцию плазмиды pCpG-KH11

Источник углерода, 0,5%	Выход биомассы клеток с 1 л КЖ, г	Выход пДНК с 1 л КЖ, мг
Глюкоза	5,3±0,15	2,4±0,12
Глицерин	5,8±0,17	5,3±0,3
Сукцинат натрия	2,5±0,07	5,0±0,2
Цитрат калия	0,001	-*
Сахароза	0,001	-*

*- пДНК не выделяли вследствие низкого выхода клеточной биомассы

Из представленных данных видно, что наибольший выход целевой плазмиды дает культивирование бактериального штамма в среде с использованием в качестве источника углерода глицерина или сукцината натрия.

Важным компонентом питательной среды является источник фосфора. Неорганический фосфат поддерживает рН среды и обеспечивает клетки фосфором, необходимым для биосинтеза ДНК. Для изучения влияния различных концентраций неорганического фосфата на выход пДНК в питательную среду вносили Na₂HPO₄ и KH₂PO₄ каждого до конечной концентрации 50 мМ, 25 мМ или 12,5 мМ. Данные, отражающие зависимость выхода пДНК от концентрации неорганического фосфата представлены в таблице 2.

Таблица 2

Влияние концентрации неорганического фосфата на продуцирующую способность штамма E. coli CpG-KH11 в отношении пДНК

Концентрация Na₂HPO₄ и KH₂PO₄, мМ	Выход биомассы клеток с 1 л КЖ, г	Выход пДНК с 1 л КЖ, мг
12,5	3,0±0,1	2,7±0,1
25	5,6±0,12	5,4±0,16
50	5,8±0,14	7,6±0,25

Из представленных данных видно, что наибольший выход целевой плазмиды дает культивирование клеток E. coli CpG-KH11 на минимальной питательной среде с добавлением неорганического фосфата до конечной концентрации 50 мМ.

Азот необходим для роста бактериальных клеток и для нормального протекания метаболических процессов. Для выбора оптимального источника азота клетки E. coli CpG-KH11 выращивали на минимальной питательной среде с добавлением 12,5 мМ (NH₄)₂SO₄, 25 мМ (NH₄)₂SO₄ или 50 мМ NH₄Cl. Полученные данные суммированы в таблице 3.

Таблица 3

Выделение пДНК из клеток E. coli CpG-KH11, выращенных на

питательных средах с разными источниками азота

Источник азота	Выход биомассы клеток с 1 л КЖ, г	Выход пДНК с 1 л КЖ, мг
12,5 мМ (NH₄)₂SO₄	3,2±0,12	3,5±0,10
25 мМ (NH₄)₂SO₄	5,8±0,14	6,15±0,18
50 мМ NH₄Cl	5,2±0,12	5,1±0,20

Из представленных данных видно, что наибольший выход целевой плазмиды достигается при культивировании штамма E. coli CpG-KH11 на минимальной питательной среде с использованием в качестве источника азота 25 мМ (NH₄)₂SO₄. Это может быть связано с тем, что соль (NH₄)₂SO₄является источником не только азота, но и необходимых для роста клеток сульфат-ионов.

Для проверки влияния микроэлементов на выход пДНК клетки E. coli CpG-KH11 выращивали на минимальной питательной среде с добавлением 1-, 0,1- или 0,01-кратной смеси микроэлементов (состав 1000-кратной смеси микроэлементов: 50 мМ FeCl₃, 20 мМ CaCl₂, 10 мМ MnCl₂, 10 мМ ZnSO₄, 2 мМ CoCl₂, 2 мМ CuCl₂, 2 мМ NiCl₂, 2 мМ Na₂MoO₄, 2 мМ Na₂SeO₃, 2 мМ H₃BO₃). Полученные данные суммированы в таблице 4.

Таблица 4

Влияние концентрации микроэлементов на

способность штамма E. coli CpG-KH11 продуцировать пДНК

Содержание микроэлементов	Выход биомассы клеток с 1 л КЖ, г	Выход пДНК с 1 л КЖ, мг
Без добавления микроэлементов	5,6±0,14	5,3±0,21
1-кратная смесь	6,6±0,19	4,2±0,16
0,1-кратная смесь	6,1±0,18	4,6±0,18
0,01-кратная смесь	5,8±0,14	4,7±0,14

Из представленных данных видно, что наибольший выход целевой плазмиды обеспечивает культивирование бактериального штамма на минимальной питательной среде без дополнительного внесения в нее микроэлементов. Это может быть связано с тем, что микроэлементы способствуют приросту клеточной биомассы, тогда как отсутствие в среде источника микроэлементов приводит к концентрации всех клеточных резервов на биосинтезе пДНК.

Для оценки выхода пДНК в оптимизированных условиях клетки E.coli CpG-KH11 культивировали на двух средах – на подобранной выше минимальной питательной среде, содержащей 0,05% глюкозу, 0,5% глицерин, 0,05% изолейцин, 2 мM MgCl₂, 50 мМ Na₂HPO₄, 50 мМ KH₂PO₄, 25 мМ (NH₄)SO₄, 5 мМ Na₂SO₄ с добавлением ампициллина до 150 мкг/мл, и на богатой питательной среде ZYM505 [7]. При этом выход целевой плазмиды при культивировании клеток на оптимизированной минимальной среде составил 7,6 мг/л, а на среде ZYM505 – 5,8 мг/л.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов оптимизирован состав минимальной среды для культивирования штамма E. coli CpG-KH11 – продуцента плазмиды pCpG-KH11, содержащей 96 повторов иммуностимулирующего GTCGTT-мотива, что позволило повысить выход целевой плазмиды в 1,3 раза по сравнению с выходом на богатой питательной среде ZYM505. Полученные результаты открывают перспективу создания новых иммуностимулирующих препаратов и адъювантов для вакцин на основе CpG-ДНК [8].

Литература:

1. Krieg, A.M. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects / A.M. Krieg // Annu. Rev. Immunol. – 2002. – Vol. 20. – P. 709–760.

2. Иммуностимулирующая CpG-ДНК: перспективы клинического применения в онкологии / С.В. Олишевский [и др.] // Онкология. – 2006. – Т. 8, № 2. – С. 209–217.

3. Gupta, G.K. CpG oligodeoxynucleotides as TLR9 agonists: therapeutic application in allergy and asthma / G.K. Gupta, D.K. Agrawal // Biodrugs. – 2010. – Vol. 24. – P. 225–235.

4. Effects of medium composition on the production of pDNA vector potentially for human gene therapy / Z. Xu [et al.] // J. Zheijang Univ. Sci. – 2005. – Vol. 6B, N 5. – P. 396–400.

5. Коровашкина, А.С. Создание штамма Escherichia coli – продуцента плазмидной ДНК, обогащенной иммунотропными CpG-мотивами / А.С. Коровашкина, С.В. Квач, А.И. Зинченко // Стремления – 2011: сб. материалов II Междунар. науч.-практ. конф. мол. ученых, Минск, 14–18 ноября 2011 г. Минск, Беларуская навука, 2011. – Т. 1. – С. 184–187.

6. Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual / J. Sambrook, D.W. Russell. – 3rd ed. – NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

7. Studier, F.W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures / F.W. Studier // Protein Expr. Purif. – 2005. – Vol. 41, N 1. – P. 207–234.

8. Plasmid containing CpG oligodeoxynucleotides can augment the immune responses of pigs immunized with porcine reproductive and respiratory syndrome killed virus vaccine / Z. Quan [et al.] // Vet. Immunol. Immunopathol. – 2010. – Vol. 136. – P. 257–264.