ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ЭКСПРЕССИИ ПУРИННУКЛЕОЗИДФОСФОРИЛАЗЫ KLEBSIELLA PNEUMONIAE В КЛЕТКАХ ESCHERICHIA COLI ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ В ФЕРМЕНТЕРЕ

Береснев А.И., Рымко А.Н., Кузьмина О.Н., Квач С.В., Ерошевская Л.А., Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ЭКСПРЕССИИ ПУРИННУКЛЕОЗИДФОСФОРИЛАЗЫ KLEBSIELLA PNEUMONIAE В КЛЕТКАХ ESCHERICHIA COLI ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ В ФЕРМЕНТЕРЕ

В настоящее время значительное внимание уделяется использованию модифицированных аналогов природных нуклеозидов в биохимических, молекулярно-биологических и медицинских исследованиях. На основе модифицированных нуклеозидов синтезировано большое количество соединений, обладающих высокой противоопухолевой и противовирусной активностью. Чаще всего для получения модифицированных нуклеозидов применяют химические методы, однако появляется большое количество публикаций, описывающих их синтез с использованием ферментов микроорганизмов. Главным этапом ферментативного получения модифицированных нуклеозидов является реакция трансгликозилирования, основанная на присоединении сахарного остатка к гетероциклическому азотистому основанию [1−3].

Основными ферментами, использующимися для биокаталитического синтеза модифицированных нуклеозидов, являются нуклеозидфосфорилазы. Существует три вида нуклеозидфосфорилаз: уридинфосфорилаза и тимидинфосфорилаза, использующие в качестве субстратов пиримидиновые нуклеозиды, и пуриннуклеозидфосфорилаза (ПНФаза), специфичная к пуриновым нуклеозидам и их аналогам [4, 5].

Ранее в лаборатории биотехнологии соединений нуклеиновой природы Института микробиологии НАН Беларуси был создан штамм E. coli, экспрессирующий рекомбинантную гетерологичную ПНФазу Klebsiella pneumoniae и разработаны технологии ее применения для синтеза ряда фармацевтически важных нуклеозидов [6]. При этом культивирование штамма-продуцента E. coli до настоящего времени проводили с использованием питательной среды Луриа-Бертани в колбах Эрленмейера.

В связи с постоянно возрастающей потребностью в производстве модифицированных нуклеозидов с использованием микробных ферментов, возникает настоятельная необходимость в разработке промышленных технологий, предусматривающих применение более дешевых, чем среда Луриа-Бертани, питательных сред.

Целью настоящей работы явился подбор недорогой питательной среды, обеспечивающей высокий уровень экспрессии рекомбинантной ПНФазы K. pneumoniae в условиях ферментера.

Объекты и методы исследования. В работе использовали штамм-суперпродуцент E. coli, экспрессирующий ПНФазу K. pneumoniae. Культивирование штамма-продуцента проводили глубинным способом в 2-хлитровых колбах Эрленмейера, содержащих 0,5 л культуральной среды (1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,05 M Na₂HPO₄, 0,05 M KH₂PO₄, 0,025 M (NH₄)₂SO₄); 0,5% (w/v) глицерин, 0,05% глюкоза, 0,4% α-D-лактоза, 2 мМ MgCl₂, 20 мM сукцинат натрия, 50 мкг/мл канамицин) с использованием лабораторного шейкера (180–190 об /мин) при 37^оС.

Культивирование бактерий в ферментере Biotron LiFlus SP 60 L (Корея), содержащем 20 л солевой питательной среды, проводили в следующих оптимизированных условиях: температура 37^оС, скорость вращения мешалки 150 об/мин, избыточное давление 0,1 атм., объем подачи воздуха по отношению к объему питательной среды – 1:1. Культивирование бактериальных штамма проводили до оптической плотности культуральной жидкости (КЖ) 2,0 (l=1 см, λ=600 нм), после чего температуру ферментации снижали до 25^оС и продолжали культивирование в течение 12 ч.

Ферментативную активность ПНФазы определяли по скорости образования аденозина из аденина, с использованием инозина в качестве донора углеводного остатка [6]. За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое способно образовать 1 мкмоль продукта за 1 мин при соответствующих условиях реакции. Активность фермента выражали в ед/мг сухой биомассы клеток.

Приведенные в работе экспериментальные данные представляют собой доверительные интервалы среднего арифметического для 95%-ного уровня вероятности.

Результаты и обсуждение. В результате культивирования штамма-продуцента E. coli в 2-хлитровых колбах Эрленмейера, содержащих 0,5 л богатой питательной среды, выход фермента с единицы объема среды составил 372 200 ед/л. Для увеличения выхода фермента с единицы объема КЖ и удешевления культуральной среды нами была подобрана минимальная питательная среда. Для выбора минимальной среды были протестированы различные варианты известных солевых сред (табл. 1).

Таблица 1

Продукция ПНФазы при культивировании штамма E. coli, экспрессирующего ПНФазу K. pneumoniae, на минимальных средах

Обозна-чение среды	Состав питательной среды	Биомасса, г/л	Активность ПНФазы, ед./л
«А»	0,025 M Na₂HPO₄, 0,025 M KH₂PO₄, 0,05 M NH₄Cl, 5 мM Na₂SO₄, 0,5% (w/v) глицерин, 0,05% глюкоза, 0,4% α-D-лактоза, 10 мМ MgSO₄, канамицин (50 мкг/мл).	1,3±0,1	193 700±2500
«Б»	0,05 M Na₂HPO₄, 0,05 M KH₂PO₄, 0,025 M (NH₄)₂SO₄, 0,5% (w/v) глицерин, 0,05% глюкоза, 0,4% α-D-лактоза, 1 мМ MgSO₄, канамицин (50 мкг/мл).	1,07±0,1	159 430±1700
«В»	1,28% Na₂HPO₄∙7H₂O, 0,3% KH₂PO_4,0,05% NaCl, 0,1% NH₄Cl, 0,5% (w/v) глицерин, 0,05% глюкоза, 0,4% α-D-лактоза, канамицин (50 мкг/мл).	1,21±0,15	180 290±2100

Продолжение таблицы 1

«Г»

Среда «Г» с добавлением следующих микроэлементов: 0,05 мМ FeCl₃, 0,02 мМ CaCl₂, 0,01 мМ MnCl₂, 0,01 мМ ZnSO₄, 2 мкМ CoCl₂, 2 мкМ CuCl₂, 2 мкM NiCl₂, 2 мкМ Na₂MoO₄, 2 мкМ H₃BO₃. Концентрация глицерина увеличена до 0,7%.

1,8±0,2

268 200±2900

Как видно из данных таблицы 1, подобранная минимальная среда «Г» позволяет добиться достаточно высоких показателей по выходу биомассы (1,8±0,2 г/л сухой биомассы) и ПНФазной активности (268 200±2900 ед./л КЖ) при существенном удешевлении питательной среды.

На следующем этапе работы было проведено культивирование штамма-продуцента ПНФазы в ферментере. Процесс вели в оптимизированных условиях с использованием минимальной питательной среды «Г». При этом на различных этапах культивирования бактерий проводили контроль экспрессии ПНФазы путем измерения удельной активности фермента. Данные эксперимента представлены на рисунке 1.

Активность, ед./мл КЖ

Время, ч

Рисунок 1 − Динамика накопления ПНФазы в процессе культивирования бактерий

По окончании культивирования штамма-продуцента E. coli, экспрессирующего рекомбинантную ПНФазу, выход фермента составил 743 000±4800 ед./л КЖ при использовании минимальной питательной среды, что более чем в 2 раза превышает активность, получаемую при культивировании продуцента в колбах с применением богатой среды.

Таким образом, в результате проделанной работы оптимизированы условия культивирования рекомбинантного штамма E. coli и индукции экспрессии его клетками ПНФазы в колбах и ферментере. Показано, что конечный выход ПНФазной активности клеток E. coli при их культивировании на минимальной солевой среде в ферментере, более чем в 2 раза превышает выход ПНФазной активности клеток E. coli, выращенных на богатой среде в колбах Эрленмейера.

Литература:

1. Krenitsky, T.A. Purine nucleoside synthesis, an efficient method employing nucleoside phosphorylase / T.A. Krenitsky, G.W. Koszalka, J.V. Tuttle // Biochemistry.−1981.− Vol. 20, № 12.− P. 3615−3621.

2. Krenitsky, T.A. Correlation of substrate-stabilization patterns with proposed mechanisms for three nucleoside phosphorylases / T.A. Krenitsky // Biochim. Biophys. Acta. − 1982.− Vol. 703, № 2.− P. 247−249.

3. Lehikoinen, P.K. Investigation of a-deuterium kinetic isotope effects on the purine nucleoside phosphorylase reaction by the equilibrium-perturbation technique / P.K. Lehikoinen, M.L. Sinnolt, T.A. Krenitsky // Biochem. J.− 1989.− Vol. 257, № 2.− P. 355−359.

4. Mikhailopulo, I.A. Biologically important nucleosides: modern trends in biotechnology and application / I.A. Mikhailopulo, A.I. Miroshnikov // Mendeleev Commun. – 2011. – Vol. 21. – P. 57–68.

5. Li, N. Biocatalytic transformation of nucleoside derivatives / N. Li, T.J. Smith, M.H. Zong // Biotechnol. Advan. – 2010. – Vol. 28. – P. 348–366.

6. Береснев, А.И. Создание рекомбинантного штамма Escherichia coli, продуцирующего пуриннуклеозидфосфорилазу Klebsiella pneumoniae / А.И. Береснев, C.В. Квач, А.И. Зинченко // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты: сб. науч. тр. Т. 4; под ред. Э.И. Коломиец и А.Г. Лобанка. – Минск: Беларуская навука, 2012. – С. 22–33.