Біологічні науки / 8.Фізіологія людини і тварин

Григорова Н.В., Єщенко Ю.В., Бовт В.Д., Єщенко В.А., Чаусовський Г.О.

Запорізький національний університет

Спосіб оцінки вмісту цинку в панкреатичних острівцях

В організмі людини та тварин важливу роль відіграє цинк [4, 5]. Саме від нього залежить активність багатьох ферментів [3, 5, 6, 8]. Він підтримуює інтегральну структуру та функцію біомембран [7, 8]. В інсулоцитах цинк знаходиться у формі, легкодосяжній для цитохімічного виявлення.

Для цитохімічного визначення цинку в цих клітинах була розроблена високочутлива селективна цитохімічна реакція 8 – (п-толуолсульфоніламіно) – хіноліну (8-ТСХ) [1, 2]. Мета цієї роботи – отримати докази кількісності даної реакції та розробити спосіб мікрофлуориметричного визначення цинку в панкреатичних острівцях.

У дослідах були використані зрізи підшлункової залози золотистих хом’ячків. Шматочки залози фіксували протягом 12 год у холодному (4 º С) ацетоні. Потім їх витримували в двох ксилолах (по 15 хв у кожному), суміші 50 % ксилолу та 50 % парафіну (30 хв при 40 º С), двох рідких парафінах (по 1,5 год у кожному при 56 º С) та заливали в парафін.

Парафінові зрізи 5 – 15 мкм завтовшки витримували в двох ксилолах (по 3 хв у кожному), двох ацетонах (по 3 хв), 0,01 % ацетоновому розчині 8–ТСХ, дистильованій воді (5 хв) та замикали в гліцерин. Препарати розглядали під люмінесцентним мікроскопом з флуориметричною приставкою. Для збудження люмінесценції використовували світлофільтр ФС–1, в якості окулярного застосовували світлофільтр зі скла ЖС-18.

На препаратах в інсулоцитах визначали жовто-зелену люмінесценцію, інтенсивність якої – показник вмісту цинку в клітинах. Про відсутність метахромазії свідчить відсутність змін кольору люмінесценції при різних концентраціях в клітинах люмофору. Відсутність вицвітання препаратів під впливом променів збуджуючого світу перевіряли мікрофлуориметрією протягом 10 – 30 хв однієї і тієї ж острівцевої ділянки. При цьому не спостерігалося значних змін інтенсивністі світіння останнього.

Оскільки для збудження люмінесценції використовували світлофільтр ФС–1, який пропускає світ з довжиною хвилі більше 300 нм, оптична щільність забарвленого об’єму мусить бути мала (менше 0,2 одиниць щільністі). Це означає, що відносна погрішність флуориметричних вимірів повинна бути менше 10 %.

Підлягання законові Бугера-Ламберта було доведено флуориметрією зрізів різної товщини.

Таким чином, цитохімічна реакція 8-ТСХ у панкреатичних острівцях золотистих хом’ячків відповідає вимогам кількосної цитохімії. Тому така реакція може бути рекомендована для кількісного визначення цинку в інсулоцитах. У даному випадку помилка розподілу цинку в клітинах не має суттєвого значення. В цьому велика перевага методу мікрофлуориметрії перед абсорбційними методами цитофотометрії.

Результати мікрофлуориметрії можна перевести у відносні одиниці вмісту цинку, для чого використовується колібровочна крива. Для її побудови на вісі ординат відкладається інтенсивність світіння об’екту, на вісі абсцис – концентрація цинку (в мкг/мл стандартних розчинів).

Стандартні розчини готуються наступним чином. Перемішуються 0,43г сульфату цинку, 91 мл 1% ацетонового розчину 8-ТСХ, дистильованої води до 1л. Суміш відфільтровується через беззольний фільтр. 10 мл огарку сірки розчиняють в 100 мл ацетону. Отриманий основний розчин містить в 1 мл 10 мкг цинку. Серія стандартних розчинів готується розведенням основного розчину таким чином, щоб в 1 мл містилось 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мкг/мл цинку. Еталонний об’єкт готується шляхом просочування вказаними розчинами депарафінованих зрізів постійної товщини.

Література:

1.Берегова Т.В., Григорова Н.В., Єщенко Ю.В., Бовт В.Д., Єщенко В.А. Визначення вмісту цинку та інсуліну в острівцевих клітинах при різному функціональному стані інсулярного апарату // Фізіол.журнал. – 2007. – Т.53, №4. – С.100-104.

2. Ещенко В.А. Цитохимическое исследование цинка // Цитология. – 1978. – Т.20, №8. – С.927-933.

3. Shin S.J., Lee H.S., Kwon S.T., Kwak S.S. Molecular characterization of a cDNA encoding copper/zinc superoxide dismutase from cultured cells of Manihot esculenta //Plant Physiol. Biochem., 2005. – Vol. 43, - № 1. – P. 55-60.

4. Tudor R., Zalewsky P.D., Ratnoike R.N. Zinc in health and chronic disease //J. Nutr. Health. Aging, 2005. – Vol. 9, № 1. – P. 45-51.

5. Vallee B.L. Zinc: biochemistry, physiology, toxicology and clinical pathology //Biofactors, 1988. – Vol. 1. – P. 31-36.

6. Vallee B.L., Auld D.S. Zinc coordination, function and structure of zinc enzymes and other proteins //Biochemistry, 1990. – Vol. 29. - № 4. – P. 5647-5659.

7. Varvarra G., Traini T., Esposito P., Caputi S., Perinetti G. Copper-zinc superoxide dismutase activity in healthy and inflamed human dental pulp //Int. Endod. J., 2005. – Vol. 38, - № 3. – P. 195-199.

8. Williams R.J. Metallo-enzyme catalysis //Chem. Commun, 2003. - № 10. – P. 1109-1113.