Екологія / 6.Екологічний моніторінг
Єщенко
Ю.В., Григорова Н.В., Важненко О. В., Деревинська І. М.,
Чорна
Т.Ю., Гороховський Є.Ю., Синьока С.Ю., Параєва К.М.
Запорізький
національний університет
Вміст цинку в клітинах при дії екологічних
несприятливих факторів
ВСТУП
Вивчення впливу екстремальних
факторів на клітинний метаболізм
цинку є однією з актуальних екологічних
проблем. Цинк виконує в організмі дуже важливі екологічні функції [ 6-8 ]. Він
необхідний для активності багатьох ферментів і стабілізує клітинні мембрани [6,
8-11]. Саме при дії несприятливих екологічних факторів. Порушуються ферментативна
активність і проникність мембран [3]. У зв’язку з цим представляють значний
інтерес дослідження вмісту цинку в клітинах при дії зазначених факторів. Особливої
уваги заслуговують такі шкідливі в промисловості речовини, як сірководень і
токсичні метали. Перші здібні зв’язувати, а другі - витискувати цинк, який
знаходиться в комплексі з біолігандами.
Чутливими клітинами до дії сірководню та
токсичних металів є інсулоцити та гранулоцити крові. Дослідження проводили на
лабораторних тваринах (мишах і
щурах). Дія сірководню вивчалася в затравочних камерах. Токсичні метали (
ртуть, мідь, алюміній) уводили тваринам через зонд. Для цитохімічного
дослідження цинку брали мазки крові та зрізи підшлункової залози, котрі забарвлювали хелантами– хромофорами: дитизоном і 8-(п -
толуолсульфоніламіно) – хіноліном (8-ТСХ) [1,2].
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Матеріалом досліджень слугували мазки
крові та шматочки підшлункової залози 128 мишей і щурів. Кров для досліджень
брали з хвоста. Сульфат міді та хлорид ртуті вводили мишам та щурам через зонд
у шлунок щодня в дозі 2-5 мг/кг у вигляді 0,02 % розчину, а хлорид алюмінію -
100 мг/кг у вигляді 0,4 % розчину.
Для дослідження впливу сірководню тварин
поміщали в камеру, в якій знаходилася
суміш соляної кислоти, сульфіду натрію та дистильованої води. У посудину
ємністю 100 мл наливалася дистильована
вода, додавалося
Для цитохімічного визначення цинку в панкреатичних клітинах В шматочки
підшлункової залози фіксували протягом 12 годин у холодному ацетоні (+4 ºС).
Потім шматочки проводили через два ксилоли
(по 15 хвилин в кожному), кашу (суміш 50 % ксилолу і 50 % парафіну – протягом 30 хвилин при 37 °С), два рідкі парафіни
(по 1,5 години в кожному при 56 0С).
Шматочки заливали в парафін. Парафінові зрізи органу готували завтовшки
5 – 10 мкм. Депарафінування зрізів
проводили таким чином: обробка в двох ксилолах та двох спиртах – по 3 хвилини в кожному, промивання в дистильованій
воді – 5 хвилин.
У разі постановки
цитохімічної реакції дитизону використовували 0,2 % (робочий) водно-аміачний його розчин. Тривалість фарбування - 3 години. Розчин
дитизону готували таким чином. У колбу з кришкою, що щільно закривається, наливали 30 мл дистильованої води. Сюди додавали 0,6
мл 25 % розчину гідроксиду амонію, 400 мг дитизону. Суміш перемішували на
водяній бані при 70 °С протягом 10 хвилин, потім фільтрували через беззольний фільтр. При цьому отримували 1 % водно-аміачний (основний) розчин дитизону, оскільки
чверть його наважки залишалася на
фільтрі. Робочий розчин дитизону отримували шляхом п'ятиразового
розбавлення його основного розчину. Після
закінчення терміну фарбування препаратів зрізи промивали в двох порціях дистильованої води (по 5 хвилин у кожній) і замикали в гліцерин
- желатин. Зрізи розглядали у видимому
світлі мікроскопа. На препаратах у цитоплазмі острівцевих клітин виявлялися
гранули червоного кольору.
Для отримання
цитохімічної реакції 8-ТСХ на зріз наносили декілька крапель 0,01 % ацетонового розчину 8-ТСХ. Зріз промивали в дистильованій
воді, занурювали в гліцерин, розглядали під люмінесцентним мікроскопом. Для збудження
люмінесценції застосовували світлофільтр ФС
- 1, як захисний (окулярний) використовували
світлофільтр із скла ЖС - 18. На препаратах у цитоплазмі острівцевих клітин виявлялася зернистість, яка
люмінесціювала жовто- зеленим світлом.
Для цитохімічного виявлення цинку в гранулоцитах крові використовували фарбування
мазків за допомогою дитизону. У чашку Петрі наливали 20 мл формаліну і на її
дно клали 2 скляні палички. На останні мазками вниз поміщали предметні скла.
Чашку Петрі закривали кришкою. По закінченні терміну інкубації (5 хвилин)
кришку знімали з чашки, мазки витягали з неї і клали на дно іншої чашки Петрі.
На них за допомогою піпетки наливали робочий розчин дитизону, чашку зачиняли
кришкою.
Через 3 години кришку з чашки Петрі знімали, мазки
промивали дистильованою водою, замикали в желатин і розглядали під світловим
мікроскопом. На препаратах, у цитоплазмі лейкоцитів визначали червоні гранули.
Інтенсивність цитохімічних реакцій дитизону та 8–ТСХ у
панкреатичних клітинах В оцінювали за
трибальною системою, запропонованою В.В. Соколовським [4], а також Ф.
Хейхоу та Д. Квагліно [5]. За один бал приймали слабопозитивну, два бали –
помірну, три бали – виражену за інтенсивністю реакцію. Крім напівкількісного
методу для оцінки інтенсивності дитизонової реакції у гранулоцитах крові
використовували кількісний метод: підраховували кількість гранул у клітинах.
Обчислювали середню арифметичну (
), її
похибку (mх) і показник достовірності
(р).
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ
ОБГОВОРЕННЯ
Інтенсивність цитохімічної реакції
дитизону в гранулоцитах крові у контрольних (інтактних) тварин складала в
середньому 1,2 ± 0,10 у.о., а кількість дитизонофільних гранул в клітинах
дорівнювала 102 ± 4,7 у.о. У тварин,
що одержували ін'єкції хлориду алюмінію, інтенсивність досліджуваної реакції у
зернистих лейкоцитах складала в середньому 0,9 ± 0,08 у.о., що на 25 % менше
контролю (р < 0,05). Інтенсивність дитизонової реакції у досліджуваних клітинах після введення
сульфату міді складала 0,8 ± 0,07 у.о.,
що на 33 % нижче за норму. Приблизно так само змінювалася кількість гранул
дитизону в гранулоцитах крові. У тварин, отримавших хлорид алюмінію, кількість
дитизонофільних гранул у клітинах знизилася на 20 % (82 ± 4,3; р < 0,01).
При введенні сульфату міді вона склала 74 ± 3,1, що на 27 % менше значень
контролю (р < 0,001). У
мишей, що піддавалися дії хлориду ртуті, кількість дитизонофільних гранул дорівнювала в середньому 65 ± 3,0 у.о., що на 36 % нижче за норму (р <
0,01).
Сірководень у мишей викликав зниження інтенсивності
реакції дитизону в зернистих лейкоцитах
на 34 %, (0,8 ± 0,06 у.о.; р < 0,01). Кількість дитизонофільних
гранул склала 71 ± 3,2 у.о., що на 25 % менше норми (р < 0,01).
Таким чином, ослаблення інтенсивності цитохімічної
дитизонової реакції і скорочення кількості дитизонофільних гранул у зернистих
лейкоцитах мишей, зазнавши дії токсичних металів і сірководню, свідчить про
розвиток цинкової недостатності.
Аналогічна картина спостерігалася при
постановці дитизонової реакції у зернистих лейкоцитах щурів. У
тварин, що складали контрольну групу, інтенсивність цитохімічної
дитизонової реакції у гранулоцитах крові складала 1,4 ± 0,12 у.о., а кількість
гранул дитизону – 121 ± 7,6. У тварин,
що піддалися дії хлориду алюмінію, інтенсивність досліджуваної реакції в
клітинах знижувалася на 21 % (1,1 ± 0,06
у.о.; р < 0,05). Призначення сульфату міді щурам викликало зменшення
інтенсивності реакції дитизону в досліджуваних клітинах на 29 % (1,0 ± 0,08 у.о.; р < 0,01). Інтенсивність дитизонової реакції в
зернистих лейкоцитах після введення
хлориду ртуті складала 0,8 ± 0,06 у.о., що на 43 % нижче за норму (р <
0,001). Аналогічні зміни спостерігалися відносно кількості цинковмісних гранул
у зернистих лейкоцитах щурів. У
тварин, що були під впливом хлориду алюмінію, кількість гранул дитизону в
гранулоцитах крові зменшилася на 17 % (101 ±
7,4; р < 0,05). При введенні
сульфату міді вона дорівнювала 94 ± 6,9, що на 22 % нижче за норму (р <
0,01). Призначення щурам хлориду ртуті призвело до зменшення кількості
дитизонофільних гранул на 31 % ( 83 ± 5,7; р < 0,001). У щурів, зазанавших
впливу сірководню, інтенсивність реакції дитизону склала в середньому 0,9 ± 0,08 у.о., що на 36
% менше контрольних величин (р < 0,001). Кількість дитизонових гранул
знизилась на 27 %, при цьому їх середнє значення відповідало 88 ± 6,6 (р <
0,001).
Зниження
інтенсивності цитохімічної реакції дитизону вказує на виснаження депо цинку в
зернистих лейкоцитах крові у щурів досліджуваних груп. Зменшення кількості
дитизонофільних гранул в гранулоцитах свідчить про втрату клітинами здатності
акумулювати цинк.
При порівнянні отриманих даних звертає
на себе увагу однотипний характер змін вмісту цинку в гранулоцитах крові мишей
і щурів, що піддалися багаторазовій дії токсичних металів і сірководню, -
дефіцит цього металу.
Однотипний характер змін метаболізму
цинку в зернистих лейкоцитах крові при хронічній дії вказаних експериментальних
чинників дозволяють віднести їх до ознак загального адаптаційного синдрому.
Дефіцит цинку при хронічному стресуванні організму тварин може бути обумовлений
пригніченням інкреторної функції наднирників.
У мишей контрольної групи інтенсивність
цитохімічної реакції дитизону в
панкреатичних клітинах В становила в середньому 1,8 ± 0,11 у.о. У тварин, що
зазнавали впливу хлориду алюмінію, інтенсивність дитизонової реакції у В- клітинах острівців Лангерганса
складала в середньому 1,4 ± 0,09 у.о., що на 22 % менше в порівнянні з контрольними
величинами (р < 0,01). Після введення сульфату міді вміст цинку в
панкреатичних острівцях знизився на 33 %, (1,2 ± 0,10 у.о.; р < 0,001).
Інтенсивність дитизонової реакції у досліджених клітинах ще більшою мірою
зменшувалася в порівнянні з контролем у мишей, що одержували розчин хлориду
ртуті. При цьому інтенсивність реакції складала 1,0 ± 0,07 у.о., що на 44 %
нижче контролю (р < 0,001). У мишей, що зазнавали впливу сірководню, інтенсивність
дитизонової реакції у панкреатичних клітинах
В острівців складала у середньому 1,3 ± 0,10 у.о., що на 28 % менше у порівнянні
з контролем (р < 0,01).
Зменшення інтенсивності цитохімічної
реакції дитизону в В-інсулоцитах панкреатичних острівців тварин після
призначення їм солей металів, що мають токсичні властивості, та впливу на них
сірководню вказує на розвиток у цих клітинах цинкової недостатності
Аналогічні зміни рівня цинку в
інсулінпродукуючих клітинах у мишей, що піддавалися впливу токсичних металів та
сірководню, встановлені за допомогою цитохімічної реакції 8-ТСХ. У контрольних
(інтактних) тварин у клітинах В панкреатичних острівців інтенсивність 8-ТСХ -
реакції становила в середньому 1,9 ± 0,12 у.о. Введення хлориду алюмінію
викликало зниження інтенсивності реакції
8-ТСХ у досліджених клітинах на 21 % (1,5 ± 0,13 у.о.; р < 0,05). У
мишей, що одержували сіль міді, інтенсивність реакції 8-ТСХ склала 1,4 ± 0,11
у.о., що на 26 % нижче в порівнянні з контрольними величинами (р < 0,01). Призначення
хлориду ртуті тваринам призвело до зменшення інтенсивності дослідженої реакції
у В-інсулоцитах на 37 % (1,2 ± 0,08 у.о.; р < 0,001). Дія сірководню
викликала зниження інтенсивності реакції 8-ТСХ у В- клітинах острівців на 26 % (
1,4 ± 0,10 у.о.; р < 0,001).
У контрольних щурів інтенсивність
реакції дитизону в панкреатичних В – клітинах складала в середньому 0,5 ± 0,04
у.о. У тварин, які піддавалися впливу хлориду алюмінію, інтенсивність
дослідженої реакції в підшлунковій залозі складала в середньому 0,4 ± 0,03
у.о., що на 20 % менше в порівнянні з контролем (р < 0,05). Введення хлориду
ртуті викликало зниження інтенсивності дитизонової реакції в досліджених
клітинах на 40 %, при цьому середня величина інтенсивності реакції дорівнювала
0,3 ± 0,02 у.о. (р < 0,001). Інтенсивність дитизонової реакції у щурів,
зазнавших впливу сірководню, складала в середньому 0,4 ± 0,01 у.о., що на 20 % менше значення норми (р < 0,05).
Зменшення інтенсивності цитохімічної реакції дитизону в В – інсулоцитах
у щурів після введення їм солей
токсичних металів і дії сірководню вказує,
як і у мишей, на розвиток у цих
клітинах дефіциту цинку. Найбільш виражений дефіцит цього металу спостерігався
в випадках введення хлориду ртуті, найменш виражений - після введення хлориду
алюмінію, сульфату міді та дії сірководню.
За
допомогою цитохімічної реакції 8 -ТСХ у панкреатичних клітинах В щурів, що
багаторазово піддавались впливу токсичних металів, встановлений подібний
дитизоновій реакції характер змін вмісту цинку. У інтактних тварин, які
складали контрольну групу, інтенсивність 8-ТСХ – реакції у досліджених клітинах
становила в середньому 0,6 ± 0,05 у.о. У щурів, що одержали хлорид алюмінію,
інтенсивність реакції у В-клітинах острівців складала в середньому 0,5 ± 0,04
у.о., що на 17 % нижче норми (р < 0,05). Після введення сульфату міді
інтенсивність реакції 8-ТСХ у цих клітинах зменшилась в порівнянні з контролем
на 33 % (0,4 ± 0,03 у.о; р < 0,01). Призначення хлориду ртуті викликало
зниження інтенсивності 8-ТСХ – реакції на 50 % (0,3 ± 0,01 у.о.; р<
0,001). Вплив сірководню
призводив до зниження інтенсивності 8-ТСХ – реакції на 33 % ( 0,4 ± 0,02 у.о.; р < 0,01).
При порівнянні отриманих даних
простежується однотипність змін вмісту цинку в
гранулоцитах крові та панкреатичних клітинах В у мишей і щурів, які
піддалися дії токсичних металів і сірководню, - дефіцит цинку в клітинах.
З огляду на той факт, що токсичні метали (алюміній, мідь
і ртуть) і сірководень можна віднести до стресогенних факторів хімічної
природи, то дефіцит цинку, що розвивається внаслідок багаторазового їхнього
впливу, можна віднести до ознак неспецифічного адаптаційного синдрому клітинної
системи (НАСКС).
ВИСНОВКИ
1.
Внаслідок впливу токсичних металів і сірководню
в гранулоцитах крові та панкреатичних клітинах В у мишей і щурів, розвивається
дефіцит цинку.
2. Цинкова
недостатність у клітинах тварин при дії токсичних металів пояснюється
витискуванням цинку з його комплексів з біолигандами.
3. Дефіцит цинку при дії сірководню
обумовлений зв’язуванням цього металу та наступним виведенням його із
клітин.
ЛІТЕРАТУРА
1. Берегова Т.В., Григорова
Н.В., Єщенко Ю.В., Бовт В.Д., Єщенко В.А. Визначення вмісту цинку та інсуліну в
острівцевих клітинах при різному функціональному стані інсулярного апарату //
Фізіол.журнал. – 2007. – Т.53, №4. – С.100-104.
2. Ещенко В.А. Цитохимическое
исследование цинка // Цитология. – 1978. –
Т.20, №8.– С.927-933.
3. Панин Л.Е. Биохимические
механизмы стресса.- Новосибирск: Наука,
1983.-232 с.
4. Соколовский В.В. Гистохимические
исследования в токсикологии.- Л.: Медицина, 1971.-172 с.
5. Хейхоу Ф., Кваглино А.
Гемотологическая цитохимия.- М.: Медицина, 1983. - 320 с.
6. Shin S.J.,
Lee H.S.,
Kwon S.T.,
Kwak S.S. Molecular characterization of a cDNA encoding copper/zinc superoxide dismutase from
cultured cells of Manihot esculenta // Plant Physiol. Biochem. – 2005. – Vol.
43, № 1. – P. 55-60.
7. Tudor
R., Zalewsky P.D., Ratnoike R.N. Zinc in health and chronic disease //J. Nutr.
Health. Aging. – 2005. – Vol. 9, № 1. – P. 45-51.
8. Vallee
B.L. Zinc: biochemistry, physiology, toxicology and clinical pathology
//Biofactors. – 1988. – Vol. 1. – P. 31-36.
9. Vallee
B.L., Auld D.S. Zinc coordination, function and structure of zinc enzymes and
other proteins // Biochemistry. – 1990. – Vol. 29. № 4.
– P. 5647-5659.
10. Varvarra
G., Traini T., Esposito P., Caputi S., Perinetti G. Copper-zinc superoxide dismutase
activity in healthy and inflamed human dental pulp //Int. Endod. J. – 2005. –
Vol. 38, № 3.– P. 195-199.
11. Williams
R.J. Metallo-enzyme catalysis //Chem. Commun. – 2003. - № 10.
– P. 1109-1113.