Изучение стабильности ассоциации дрожжевых микроорганизмов Pichia angusta, Arxula adeninovorans и Debaryamyces hansenii

Арляпов В.А.

Для оценки степени загрязненности воды в настоящее время широко применяется параметр, определенный как "индекс биохимического потребления кислорода" (БПК). Продолжительность классических тестов для определения БПК составляет 5 суток и более, что неприемлемо в ряде случаев. Для оперативного анализа разрабатываются методы оценки БПК, основанные на использовании биосенсорных анализаторов [1].

В БПК-биосенсорах в качестве распознающих элементов применяют микроорганизмы, способные метаболизировать широкий спектр органических соединений. Для создания биораспознающих элементов БПК-сенсоров используют либо чистые культуры микроорганизмов с определенными потребительскими свойствами (широкий спектр окисляемых субстратов, устойчивость к воздействию негативных факторов окружающей среды), либо ассоциации микроорганизмов (искусственные ассоциации, активный ил) [2]. Использование ассоциаций микроорганизмов позволяет существенно повысить спектр окисляемых субстратов и, соответственно, правильность определения БПК. В то же время БПК-биосенсоры на основе ассоциаций микроорганизмов могут иметь недостаточную стабильность, причиной которой является изменение состава ассоциации с течением времени.

Целью настоящей работы являлось определение стабильности во времени ассоциации дрожжевых микроорганизмов Pichia angusta BKM Y-2518, Arxula adeninovorans ВГИ 78(6) и Debaryamyces hansenii BKM Y-2482.

Клетки штаммов Debaryomyces hansenii BKM Y-2482, Pichia angusta ВКМ Y-2559 и Arxula adeninovorans ВГИ 78(6) были получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов УРАН Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина (г. Пущино). Дрожжи вида Arxula adeninovorans обладают широкой субстратной специфичностью и активно используются для анализа БПК с использованием биосенсора [3]. Дрожжи Pichia angusta отличается высокой чувствительностью к спиртам [3]. Дрожжи Debaryomyces hansenii также отличаются широкой субстратной специфичностью и устойчивостью к негативным факторам окружающей среды [3]. Таким образом, рецепторный элемент на основе ассоциации этих микроорганизмов будет сочетать в себе широкую субстратную специфичность, высокую чувствительность и устойчивость к неблагоприятным условиям среды.

Были получены кривые роста дрожжевых штаммов A. adeninovorans, P. angusta и D. hansenii. Кривую роста микроорганизмов регистрировали спектрофотометрическим методом, снимая зависимость оптической плотности культуральной жидкости от времени. Проводя сравнительный анализ кривых роста можно отметить, что дрожжи Debaryamyces hansenii имеют более длительную лаг-фазу (21 час). А штамм A. adeninovorans имеет длительные фазы экспоненциального, линейного и замедления роста, что приводит к более позднему выходу на стационарную фазу. На кривой роста штамма Pichia angusta наиболее длительной фазой, по сравнению с другими штаммами, была фаза замедления роста, которая началась уже через 14 часов посева. Таким образом, микроорганизмы P. angusta имеют большую скорость роста чем A. adeninovorans, D. hansenii.

Для изучения устойчивости во времени созданной ассоциации дрожжевых микроорганизмов было проведено исследование субстратной специфичности рецепторных элементов биосенсора на основе отдельных дрожжевых штаммов A. adeninovorans, D. hansenii, P. angusta и их ассоциации. Клеточное дыхание регистрировали, используя кислородный электрод типа Кларка, на поверхности которого располагали рецепторный элемент. В качестве метода иммобилизации применялась адсорбция на стекловолокне.

Оценка субстратной специфичности ассоциации иммобилизованных микроорганизмов P. аngusta, A. adeninovorans и D. hansenii проведена с использованием субстратов, относящихся к различным классам органических соединений: спирты, углеводы, аминокислоты, карбоновые кислоты, альдегиды. За 100% был принят максимальный сигнал каждого сенсора, ответы сенсора на остальные субстраты даны в процентных отношениях к максимальному ответу (рисунок 1).

а	б

Рисунок 1. Субстратная специфичность рецепторных элементов. а – рецепторные элементы на основе отдельных штаммов микроорганизмов; б - рецепторные элементы на основе ассоциации микроорганизмов в разное время после создания.

Установлено, что штамм P. angusta хорошо окисляет спирты, органические кислоты и альдегиды. Сенсор на основе дрожжевого штамма D. hansenii дает высокие ответы на спирты и углеводы, а так же на органические кислоты и альдегиды. К достоинствам сенсора на основе штамма A. adeninovorans можно отнести его способность к окислению органических кислот и альдегидов.

При изучении субстратной специфичности рецепторных элементов на основе ассоциаций дрожжевых штаммов в промежутке времени 6 недель показано, что к третьему измерению в составе ассоциации остались практически только клетки дрожжевого штамма Pichia angusta. Об этом свидетельствует наличие ответов биосенсора на метанол, пропанол, глицерин, муравьиную кислоту, формальдегид и отсутствие ответов на третбутанол, который не окисляется микроорганизмами Pichia angusta и маннозу и глутаминовую кислоту, которые плохо окисляются данными микроорганизмами. Однако наличие ответа биосенсора на основе ассоциации микроорганизмов на глюкозу в течение всего времени эксперимента свидетельствует о некоторой выживаемости и других микроорганизмов, входящих в ассоциацию.

Культуры микроорганизмов и их ассоциации, высеянные на твердой среде исследовались методом светового микроскопирования. Из проведенных микроскопических исследований сделан вывод, что клетки микроорганизмов A. adeninovorans имеют четко выраженную палочковидную форму, клетки D. hansenii имеют овальную форму, а клетки P. angusta крупные, имеют шаровидную форму. В образцах первого посева ассоциации отчетливо видны клетки всех трех штаммов. В образцах второго посева также присутствуют клетки трех штаммов, но количество клеток дрожжей A. adeninovorans и D. hansenii уменьшилось. В образцах третьего посева четко видны только клетки P. angusta.

Таким образом, ассоциация трех штаммов в пропорции 1:1:1 за шесть недель заметно изменилась, доминирующим стал штамм P. аngusta. Скорее всего это связано с более высокой скоростью роста данных микроорганизмов (см. таблица 1). Исходя из полученных данных, при создании ассоциаций микроорганизмов рекомендуется использовать штаммы с близкими скоростями роста.

Работа выполнена в рамках гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых – кандидатов наук, договор № 16.120.11.4341-МК.

1. D’Souza S.F. Microbial biosensors // Biosens. Bioelectron. 2001. V. 16. Р. 337–353

2. Rodriguez-Mozaz S., de Alda M.J.L., Barcelo D. Biosensors as useful tools for environmental analysis and monitoring. // Anal. Bioanal. Chem. 2006. V 386, N 4, Р. 1025-1041.

3. Satyanarayana T., Kunze G. Yeast Biotechnology: Diversity and Applications. / Springer Science, Business Media B.V., 2009, 744 р.