Аксенова П.В., к. биол. н.

Айбазов М.М., д. с.-х. н.

Россия, Ставропольский НИИ животноводства и кормопроизводства

Россельхозакадемии

Развитие эмбрионов коз in vitro в новой среде

для культивирования

Культивирование доимплантационных зародышей млекопитающих вне организма является необходимым звеном при проведении экспериментально-эмбриологических исследований, а также эмбриотехнологических работ по клонированию и получению трансгенных животных. Существенный процент детей рожден благодаря программе ЭКО, которая включает в себя культивирование и оплодотворение яйцеклеток in vitro. Для оплодотворения in vitro ооцитов человека широко применяется сложная среда Хэма F-10 (Loutradis D.K., Kiessling A.A., Kallianidis K. е.а. 1993). Экспериментально доказано, что в этой среде эмибрионы мышей и человека способны развиваться до стадии бластоцисты и вылупляться из зоны пеллюцида (Shirley B., Wortham E.J., Witmyer J. е. a., 1985; Kruger T.F., Stander F.S.H., Smith K., Lombard C.J., 1986; Dandekar P.V., Glass R.H., 1990). Однако имеются сообщения, что при культивировании в этой среде отмечена низкая оплодотворяемость яйцеклеток и увеличена частота цитоплазматической фрагментации эмбрионов (Downs S.M., Dow M.P.D., 1991; Loutradis D.K., Kiessling A.A., Kallianidis K. е. a. 1993; Dienhart M.K., Downs S.M., 1996; Dienhart M.K., O’Brien M.J., Downs S.M., 1997). В состав питательных сред для культивирования доимплантационных эмбрионов млекопитающих, как правило, вводят сыворотку крови теленка (FCS) или сывороточный альбумин (Carney E.W., Foote R.H., 1991). Описаны эксперименты по культивированию эмбрионов человека в среде альфа-МЕМ с различными белковыми добавками, культивирование кроличьих зигот в среде DMEM, смеси сред в смеси сред DMEM—RPMI 1640, среде 199 (Noda Y., Shiotani M., Goto Y., Nakagama T. е.а., 1994; Desai N., Kinzer D., Loeb A., Goldfarb J., 1997).

Технологии манипуляции с эмбрионами в ветеринарии значительно отстают от медицинских. Однако, даже в медицине, при использовании последних технологий процент успешных беременностей при ЭКО составляет всего 15-25% за цикл. Низкая приживляемость обусловлена эмбриональными потерями из-за нарушения развития эмбрионов или неспособности к имплантации. Доказано, что одной из главных причин этого является несовершенство сред для культивирования ооцитов и эмбрионов in vitro. Поэтому актуальным остаются создание новых и совершенствование существующих сред для культивирования доимплантационных эмбрионов млекопитающих.

Нами была разработана новая среда для культивирования ооцитов и доимплантационных эмбрионов коз оригинального состава.

Цель описываемого эксперимента состояла в том, чтобы установить качество новой среды для культивирования эмбрионов коз в сравнении с известными.

Эмбрионы, предназначенные для экспериментов получали от коз зааненской породы. Полиовуляцию у коз индуцировали последовательным введением мегестрола ацетата, ФСГ-питуитарного и сывороточного хорионгонадотропина. Охоту выявляли с помощью козлов-пробников. Коз осеменяли свежеполученной спермой двукратно. Вымывание эмбрионов производили с помощью лапаротомии на 3 день после осеменения (день осеменения принимали за нулевой день). В качестве промывной жидкости использовали фосфатный буферный раствор.

Эмбрионы оценивали под микроскопом. Для эксперимента выделяли эмбрионы сферической формы с четкими границами бластомеров с хорошо различимыми клеточными мембранами.

Эмбрионы помещали в пластиковые чашки Петри со средами культивирования. Затем по 5-6 зародышей помещали в стеклянные силиконизированные капилляры. Объем культуральной среды в капилляре составлял около 20 мкл. Капилляры заполняли таким образом, чтобы на концах оставались пузырьки воздуха. Затем капилляры помещали в стеклянные флаконы под слой парафинового масла. Флаконы заполняли трехкомпонентной газовой смесью (5% CO2, 5% O2 и 90% N2), плотно закрывали, опускали в сосуд с водой и помещали в термостат при 37°С. Через 72 ч. культивирования подсчитывали число бластоцист, а через 96 ч. число вылупившихся бластоцист. Вылупившимися считали эмбрионы, полностью вышедшие из зоны пеллюцида.

Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1- Результаты культивирования эмбрионов

Показатели	Среда
	1 группа DМЕМ	2 группа DМЕМ с 20% FCS	3 группа среда Хэма F-10	4 группа опытная среда
эмбрионов в опыте, n	10	10	10	12
Достигли стадии бластоцисты n %	7 70,0	8 80,0	8 80,0	12 100,0
Вышли из зоны пеллюцида n %	5 50,0	6 60,0	5 50,5	10 83,3
Прикрепились к капилляру, + -	-	+	-	+
Дали разрастание трофэктодермы + -	-	+	-	+++

Из эксперимента следует, что двуклеточные эмбрионы коз успешно развиваются до бластоцисты и вылупляются из зоны пеллюцида в разработанной нами среде. При этом процент развития эмбрионов на 23,3%-33,3% выше, чем в стандартных средах. Эмбрионы, культивируемые в данной среде, обладают выраженной способностью прикрепляться к субстрату и давать разрастание клеток трофэктодермы.