Биологические науки/5.Молекулярная биология

д. с.-х. н. Рамазанов А.У., к. с.-х. н. Темирбекова Г.А.

ТОО «Северо-Казахстанский научно-исследовательский институт животноводства и растениеводства»

ДНК – ТЕХНОЛОГИИ И ИЗУЧЕНИЕ ГЕНОФОНДА ПТИЦ

СЕВЕРО-КАЗАХСТАНСКОЙ ОБЛАСТИ

Современный этап развития биотехнологии, основанный на широком использовании ДНК-технологий, представляет удивительное явление, когда разработка комплекса новых научных методологий дает мощный импульс в понимании структурно-функциональной организации живой материи и ее эволюционного развития.

Бурному прогрессу ДНК-технологий способствовало то, что сразу была осознана огромная их важность и перспективность в решении многих проблем экологии, биологии, медицины, промышленности и сельского хозяйства. Кроме того, впервые исследователям предоставлена возможность не только изучать механизмы жизнедеятельности организмов, но и сознательно планировать изменения в них.

Именно благодаря развитию ДНК-технологий становится все более очевидным определенное единообразие стабильности и изменчивости материала наследственности, как на уровне отдельной нуклеотидной последовательности, так и в совокупности организмов, образующих общий генофонд. Необходимо подчеркнуть, что все методы ДНК-технологий, связанные с созданием новых генных конструкций и новых организмов, основаны на искусственной имитации процессов, реально существующих в живой природе.

Разработка ДНК-технологий во многом определила справедливость прогноза о том, что решающую роль в развитии и существовании мирового сообщества будет играть биология. Ее достижения, наряду с информатикой, позволят вплотную подойти к формированию ноосферы, обеспечивающей удовлетворение возрастающих потребностей человечества при сохранении окружающей среды.

Селекция по генотипу имеет преимущества перед традиционными методами. Она не учитывает изменчивость хозяйственно-полезных признаков, обусловленную внешней средой, делает возможным оценку животных в раннем возрасте независимо от пола животных и в конечном итоге повышает эффективность селекционной работы. Поэтому, для совершенствования селекционно-племенной работы в регионах предложена программа внедрения маркерной селекции.

Существенная роль в программе отводится организации и проведению исследований животных на молекулярно-генетическом уровне или по ДНК- маркерам [1].

Проведение предселекционных исследований, включающих в себя все этапы работы с генофондом, поддержания и изучения до правовых аспектов авторства на доноры и источники ценных признаков. Чтобы служить эффективной информационной базой для улучшения пород, сохраняемое в центрах генетических ресурсов сельскохозяйственных животных и птиц, а также генных банках генетическое разнообразие должно быть тщательно и всесторонне изучено. Организация центра сбора информации подразумевает идентификацию, паспортизацию и сохранение генетической целостности информации о базовых породах сельскохозяйственных животных и птиц [2].

Для успешного внедрения современных методов биотехнологии сельскохозяйственных птиц с целью совершенствования биотехнологии воспроизводства для ускоренного получения ценных генотипов с высоким уровнем продуктивности и создание банка биоматериалов (гамет и эмбрионов) малочисленных и исчезающих кроссов птиц необходимо создать информационный банк данных о генном состоянии птиц вовлекаемых в процесс [3].

В последние годы метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) и его модификации стали занимать одно из важнейших мест в современной биотехнологии. Принципом этого метода является обнаружение различных биологических объектов, специфических фрагментов ДНК в исследуемом материале.

ПЦР – ферментативная реакция, проходящая при высоких температурах. Выход реакции и специфичность её зависят от концентраций реагирующих веществ и катализаторов, входящих в реакционную смесь, а также от оптимального подбора значений температур денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройки матрично-праймерного комплекса, от количества циклов [4,5,6].

Материалом для исследования послужили образцы крови от четырех внутрипородных типов экспериментальных уток с цветным оперением породы БЦ1 и БЦ2 - «Бишкульские цветные», Б1 и Б2 – экспериментальный кросс «Белогрудый» Северо-Казахстанской области по 30 голов.

Для изучения полиморфизм длин рестрикционного фрагмента в участке митохондриального ДНК у различных пород и внутрипородных линий уток использовался метод ПДРФ митохондриального генома.

Для этого к 3,0 мл свежей крови с консервантом добавляли 1 мл ТЕ буфера следующего состава (1М Tris HCL, pH=7,5, 0,5М ЭДТА, pH=8,0) тщательно перемешивали и от центрифугировали при 7000 об/мин. После центрифугирования верхнюю фракцию удаляли, оставляя осадок лейкоцитов, затем к осадку добавляли 200 мкл лизирующего буфера следующего состава (1,6М Сахароза, 0,5М ЭДТА, pH=8,0, 1М Tris HCL, pH=8,0, 10% SDS), и протеиназу К в конечной концентрации 200 мкг/мл. Лизис лейкоцитов проводили в термостате при 63°С в течение ночи. После инкубации к лизату добавляли равный объем свежеприготовленного насыщенного буфером фенола. Переносили верхний слой, содержащий ДНК в отдельную 1,5 мл эппендорфскую пробирку, затем к осадку добавляли смесь хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 24:1. Затем снова переносили верхнюю фракцию в отдельную 1,5 мл эппендорфскую пробирку. ДНК осаждали 2 объемами этанола. После чего промывали 70 % этанолом, подсушивали в термостате и растворяли в 20 – 50 мкл ТЭ - буфером, в зависимости от концентрации ДНК. Выделенные образцы ДНК хранили при – 20°С.

ДНК из ткани выделяли этим же методом: к 2 мм² ткани (кожа) добавляли 200 мкл лизирующего буфера и протеиназы-К в конечной концентрации 200 мкг/мл. Смесь инкубировали при 63⁰С течение ночи. После инкубации к лизату добавляли смесь хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 24:1. Затем переносили верхнюю фракцию в отдельную 1,5 мл эппендорофскую пробирку. ДНК осаждали 2 объемами этанола. После чего осадок промывали 70 % этанолом, подсушивали в термостате и растворяли в 20 – 50 мкл ТЭ - буфером, в зависимости от концентрации ДНК. Выделенные образцы ДНК также хранили при – 20 °С. Таким образом был создан банк ДНК от всех исследуемых кроссов птиц.

Концентрацию ДНК проверяли на 1% агарозном геле с использованием горизонтального гель – электрофореза. Образцы с низкой концентрацией ДНК или с высокой концентрацией белка исключали из опыта. ДНК для исследования использовали до концентрации 10 нг/мкл.

Литература:

1. Марзанов Н., Филатов А. Генетические маркеры в селекции свиней. – Свиноводство, 2005.- №2.- С. 2-4

2. Глазко В.И., Дунин И.М., Глазко Г.В., Калашникова Л.А. Введение в ДНК-технологии.- ФГНУ.- Москва, 2001.

3. Батырханов М.С., Тореханов А.А., Бурабаев А.А., Медетова А.К. Методы проведения ПЦР – амплификации.- Методические рекомендации.- Алматы, 2006.- 35 с.

4. Зиновьева Н.А. Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных.- Дубровицы, 2003.

5. Глазко В.И., Глазко Г.В. Русско-англо-украинский толковый словарь.-КВIЦ.- Киев, 2001.

6. Зиновьева Н.А. Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных.- ВИЖ, 2002 / Genetic engineering with PCR / 1998.