Tumakaev R.F., Yafarova G.G., Bashirov F.V.

Conservative therapy in treatment of spinal pathology

Abstract

In spite of the wide progress in the pharmacotherapy of patients with spinal cord injury the question about the complete functional recovery of spinal cord after le-sion remains a big challenge for the restorative medicine and neuroscience. Nu-merous attempts to stimulate the spinal cord regeneration after injury are still not successful. The course of destructive changes defined by the vascular theory of the progressive pathophysiological processes in the spinal cord after injury allows the possibility to support the local cerebral blood flow and functional statement of spi-nal tract by treatment with certain type of pharmaceutical preparations. The subject of current investigation is the analysis of dimephosphon influence on spinal cord regeneration. Dimephosphon was synthesized in the Institute of organic and physi-cal chemistry of A.E. Arbuzov (Kazan, Russia). First it was applied in clinical practice as an antioxidative and membrane stabilizing agent. To identify the effect of dimephosphon on spinal tract recovery after lesion adult dogs were exposed to spinal cord injury and treated with dimephosphon for the time course of experi-ment. The impact of intravenously dimephosphon injection was studied by means of transcranial magnetic stimulation and stimulation electromyography. Morpho-logical analysis was performed on paraffin sections of spinal cord with hematoxy-lin-eosin staining. Previous experimental and clinical studies have shown the noot-ropic effect of dimephosphon on the local cerebral blood flow, the responsiveness of cerebral vessels and oxygen tension. However the variety and universality of dimephosphon influence should be considered as consistent with its concentration. In our experiments we used 50%, 25%, 10%, 5%, 2.5% and 1.5% solutions of di-mephosphon. We have shown that dimephosphon injected intravenously as a 2.5% solution promotes the functions recovery of spinal tract under spinal cord injury displaying positive effect on bloodstream and neuronal activity. This experimental evidence allows to recommend dimephosphon for patients with spinal cord injury employing intravenous injection starting from evacuation stage in hospital.

Key words: spinal cord injury, dimephosphon, electromyographic and histological studies.

Тумакаев Р.Ф. ¹, Яфарова Г.Г. ¹, Баширов Ф.В. ²

Консервативная терапия в ведении спинальной патологии

¹Государственное автономное учреждение здравоохранения "Республиканская клиническая больница МЗ РТ»

420064, г. Казань, Оренбургский тракт д. 138Б

²Кафедра оперативной хирургии и топографической анатомии Казанского государственного медицинского университета

420012, г. Казань, ул. Бутлерова д. 49

Резюме

Проведена оценка влияния препарата димефосфон, применяемого в клинике в качестве вазоактивного средства при травматическом повреждении головного мозга, на восстановление функций спинного мозга у собак при его травматическом поражении. Травму спинного мозга наносили по модифицированной методике Allen. В опытной группе животным внутривенно вводили 2,5% раствор димефосфона в дозе 18,75 мг/кг с первого по 10 дни после травмы. Восстановление проводимости спинальных путей и состояние пояснично-кресцовых мотонейронов оценивали при помощи метода магнитной стимуляции коры, используя комплекс “Нейротест”, который включает транскраниальный магнитный стимулятор и компьютерный анализатор и метода стимуляционной электромиографии, позволяющего регистрацию рефлекторных (Н-) и моторных (М-) ответов. Клиническими методами оценивали обще состояние животных, двигательную активность и болевую чувствительность. Морфологический анализ проводили на парафиновых срезах спинного мозга, окрашенных гематоксилин-эозином. Установлено, что димефосфон способствует снижению интенсивности процессов некроза и апоптоза и восстанавливает функции поврежденных отделов спинного мозга.

Ключевые слова: травма спинного мозга, электромиографические и гистологические исследования, применение димефосфона.

Введение

В основе динамики структурных изменений в спинном мозге после травмы лежит ряд последовательных событий: механическая деформация – разрыв микрососудов – экстравазация крови – частичный лизис эритроцитов – высвобождение значительного количества прооксидантов – ионов железа и меди, являющихся катализаторами свободнорадикального перекисного окисления липидов мембран. Эти события усугубляют вазоспазм, вызывают окклюзию, разрыв компонентов микроваскулярного ложа и в дальнейшем приводят к необратимым изменениям нервных клеток [1]. Ход подобных деструктивных изменений, укладывающихся в рамки сосудистой теории предполагает возможность применения медикаментозных препаратов для лечения травмы спинного мозга.

В экспериментальных и клинических исследованиях показан широкий спектр биологической активности препарата димефосфон (Dimephosphon, диметиловый эфир 1,1-диметил-3-оксобутилфосфоновой кислоты): противовоспалительная активность, противоотечное, иммуномодулирующее, антигипоксическое и антиоксидантное, противоишемическое действие, стимуляция регенераторных процессов, также воздействие на метаболизм, направленное на поддержание гомеостаза на оптимальном уровне, в частности, стимулирующее активность многих ферментных систем. Широкий диапазон фармакологических эффектов объясняется нормализующим влиянием на процессы перекисного окисления липидов [2-5, 6]. В некоторых работах показана нейрометаболическая активность димефосфона [3, 4].

Опираясь на результаты предыдущих работ, в настоящей работе мы исследовали влияние димефосфона, для восстановления функций поврежденного спинного мозга у взрослых собак.

Материалы и методы

Эксперименты выполнены на 28 половозрелых беспородных собаках (самцы и самки). Под диссоциативной анестезией (кетамин, 6-8,0 мг/кг, внутримышечно) с добавлением местной анестезии наносили стандартную открытую позвоночно-спинномозговую травму на уровне первого поясничного позвонка по модифицированной методике Allenа (1914) [7]. Первой группе животных (контроль, n=14) наносили только открытую позвоночно-спинномозговую травму без применения медикаментов. Во второй группе животным (опыт, n=14) с 1 по 10 день после травмы ежедневно по одному разу внутривенно вводили димефосфон в виде 2,5%-ного раствора (18,75 мг/кг).

Состояние мотонейронов и проводимость спинальных путей оценивали на 1, 3, 7, 14, 21, 30 и 45 сутки после операции как в контрольной, так и опытной группах.

Ежедневно вели клинические наблюдения, оценивая общее состояние животных (двигательная активность, болевая чувствительность, физиологические функции и т.д.).

Функциональную активность мотонейронов пояснично-кресцового отдела спинного мозга изучали методом стимуляционной электромиографии, использовав электромиограф фирмы “Медикор”, для этого регистрировали рефлекторный (Н-) и моторный (М-) ответы. Для стимуляции двигательной зоны коры головного мозга использовали комплекс “Нейротест”, который включает в себя транскраниальный магнитный стимулятор и компьютерный анализатор (г. Новосибирск). Для тестирования болевой чувствительности использовали покалывание кожи конечностей и туловища животного, щипки кожи лап и туловища, надавливание на кожу лап пинцетом.

Для морфологического анализа на 10-е сутки после спинальной травмы собак усыпляли летальной дозой кетамина и извлекали участок спинного мозга длинной 5 см, включающий зону контузии. Образцы фиксировали в 4%-ном растворе формалина (pH 7,4) в течение суток, промывали в растворе фосфатного буфера (pH 7,4), обезвоживали и заливали в парафин по стандартной гистологической методике. Микротомные срезы толщиной 10 мкм окрашивали гемотоксилин-эозином и анализировали при помощи светового микроскопа (Zeiss) при увеличении ×20, ×40, ×100.

Результаты и обсуждение

У животных первой группы после операции наблюдалось полное угнетение рефлексов задних конечностей и нарушение функции тазовых органов. Восстановление тонуса мышц отмечено через 1,5-2 недели после травмы. Попытки помочь животному приподняться в момент кормления были тщетны, поскольку по истечении месяца животное не могло самостоятельно опираться на задние лапы. Чувствительность туловища, конечностей и хвоста была нарушена. Отмечались попытки передвижения на передних лапах при атаксичных волочащихся задних конечностях. У отдельных животных через месяц восстанавливалась функция тазовых органов, появлялись попытки опереться на задние конечности путем их подтягивания, но эти усилия не оканчивались успехом. Сроки выживаемости в данной группе составили от 3 дней до 35 суток после операции. Летальность была связана в остром периоде с развитием восходящего отека на фоне спинального шока, а в более поздние сроки животные отказывались от приема пищи.

У животных второй группы спинномозговые рефлексы, регистрируемые дистальнее места травмы, были снижены в первые дни после операции. В мышцах задних конечностей у большинства животных определялась гипотония. Появление анестезии кожи конечностей и туловища отмечали сразу после травмы спинного мозга. Анестезия сменялась на гипостезию уже к концу первых суток, но сохранялась на коже дистальных отделов конечностей и хвоста до третьих суток. На третьи сутки собаки проявляли интерес к корму, во время еды приподнимались на задних лапах, самостоятельно ставили ступни и на некоторое время придавали конечностям обычное положение. В ряде случаев самостоятельное стояние животных наблюдалось и вне акта еды. Во время стояния собаки вначале опирались на тыльную поверхность, широко расставляя лапы. На пятые сутки наблюдения все животные становились активными и подвижными, продолжительное время стояли на конечностях и самостоятельно передвигались, лишь у одного животного на этом сроке наблюдения сохранился легкий нижний парапарез, более выраженный слева. При медленной ходьбе тонус мышц задних конечностей у животных этой группы был достаточен для обеспечения шагательных движений, а при быстрой ходьбе уменьшался. Продолжал увеличиваться тонус мышц задних конечностей и, одновременно, отмечалось восстановление чувствительности задней части туловища, хвоста и задних конечностей, что находило свое выражение в появлении ответных реакций при почесывании или покалывании иглой соответствующих частей тела, лап и хвоста. На шестые сутки наблюдения общее состояние животных могло квалифицироваться как хорошее. Собаки прибавляли в весе, волосяной покров приобретал опрятность. В этот период увеличивалась продолжительность стояния на всех лапах без развития признаков утомления, во время ходьбы улучшалась координация движений. По истечении семи суток наблюдений состояние животных продолжало улучшаться – они долго и прочно стояли на лапах, шагательные движения были хорошо координированы, чувствительность туловища, конечностей и хвоста восстанавливалась. Большую часть времени собаки проводили в движении, наблюдалось нормальное отправление всех физиологических функций при хорошем аппетите и нормальной температуре тела.

До нанесения травмы максимальная амплитуда Н-ответа составила в среднем 1,4±0,2 мВ, М-ответа – 4,0±0,5 мВ, а отношение максимальных амплитуд Н- и М-ответов - 39±6 %. Анализ Н- и М-ответов квадратной мышцы подошвы у животных контрольной группы после операции показала разнонаправленные изменения амплитуды Н-ответов, но в целом отмечалось ее незначительное снижение по сравнению с показателями, полученными до травмы. Так, значение H/M у животных этой группы было выше, чем у интактных животных (здоровые собаки до нанесения травмы), с максимумом на 13-е сутки после операции. Данное увеличение обусловлено незначительным снижением амплитуды Н-ответов на фоне значительного понижения максимальных амплитуд М-ответов, что может быть связано с развитием паралича задних конечностей. Тем не менее, общее увеличение соотношения максимальных амплитуд Н- и М-ответов дает основание говорить об увеличении пула реагирующих мотонейронов.

В опытной группе животных на десятые сутки после операции наблюдалось снижение показателя Н/М, связанное со значительным уменьшением амплитуды Н-ответов, хотя в восстановительном периоде амплитуда Н-ответов постепенно возрастала. Полученные результаты указывают на то, что применение димефосфона, возможно, приводит к уменьшению возбудимости реагирующих мотонейронов в остром периоде спинальной травмы.

При транскраниальной магнитной стимуляции у всех интактных животных были зарегистрированы моторные ответы передних большеберцовых мышц. Пороговая сила стимуляции в среднем составила 78,7±3,0%, латентный период ответов – 18,3±0,7 мс. В первой группе животных, начиная с первых суток после нанесения травмы, транскраниальная стимуляция не приводила к возникновению ответов в передней большеберцовой мышце. Выявлена отчетливая корреляция с неврологической картиной, что свидетельствует о дисфункции пирамидного тракта на уровне травмы. У животных, которым вводили димефосфон, транскраниальная стимуляция вызывала моторные ответы в передних большеберцовых мышцах у 90% собак уже через сутки после травмы. Моторные ответы регистрировались на протяжении всего эксперимента. При исследовании динамики порога Н-ответа передней большеберцовой мышцы у данной группы животных выявлено, что для вызова моторных ответов в мышцах задних конечностей требовалась меньшая сила раздражения коры головного мозга, чем у интактных животных. Через 30 суток после операции эти показатели возвращались к исходному дооперационному уровню. Полученные результаты указывают на то, что применение димефосфона способствует быстрому восстановлению проведения сигналов по поврежденному сегменту спинного мозга. Снижение порога H-ответа при транскраниальной магнитной стимуляции в острый период может свидетельствовать как о повышении возбудимости спинальных мотонейронов в зоне травмы, так и о повышении возбудимости кортикальных мотонейронов вследствие активации восходящих путей спинного мозга.

Рисунок 1

Морфологический анализ срезов спинного мозга, выполненных на уровне очага поражения показал, что в первой группе животных на 10-й день при гистологическом исследовании наблюдался обширный отек мозговой ткани с очаговым кровоизлиянием (рис. 1A, Б), а также некротический очаг, который включал в себя остатки разрушенных клеток и клетки, участвующие в развитии воспаления, неизменно развивающегося в результате некроза. На ранних этапах некроза наблюдали картину с характерными типичными признаками, позже происходило разрушение мембран и дезинтеграция клетки. Наряду с некрозом, в момент травмы запускается механизм отсроченного (вторичного) повреждения клеток, в основе которого лежит апоптоз [8, 10, 11], представляющий собой физиологическую гибель клеток, необходимую для обновления клеточного пула органов, дифференцировки и развития тканей [9]. При микроскопическом исследовании таких клеток наблюдается конденсация ядерного хроматина, сморщивание тела клетки при сохранной цитоплазматической мембране. На гистологических срезах спинного мозга животных первой группы нами было также отмечено большое количество нейронов с признаками апоптоза (рис. 1Г, Д).

Рисунок 3

При использовании димефосфона отек спинного мозга и очаговые кровоизлияния были выражены слабо или отсутствовали (рис. 2А, Б). Нейроны передних и задних рогов не проявляли признаков апоптоза и обладали четко очерченным ядром и ядрышком без конденсации хроматина (рис 2Г, Д).

Рисунок 2

В этой группе животных на первый день после травмы также наблюдались обширные очаговые кровоизлияния (рис. 3А), однако, их постепенная редукция начинается с третьего дня (рис. 3Б-Г), а на 7-ые сутки значительно уменьшился отек мозговой ткани в зоне контузии, отсутствовали остатки разрушенных клеток, не было отмечено наличие апоптотических нервных клеток.

Рисунок 3

Результаты проведенного этого морфологического анализа положительно коррелируют с данными электрофизиологических исследований и оценкой состояния экспериментальных животных клиническими методами. Регресс очаговых кровоизлияний и отека спинного мозга на фоне введения димефосфона сопровождался нормализацией функционального состояния нейронов передних и задних рогов спинного мозга, отсутствием явных признаков некроза и апоптоза.

Таким образом, результаты исследований указывают, что димефосфон поддерживает нейрональную активность спинного мозга после травмы, что благоприятствует восстановлению функций поврежденных нейронов в зоне контузионного очага, что находит подтверждение данными микромарфологического анализа.

Выводы

1. При позвоночно-спинальной травме курсовое применение димефосфона внутривенно в дозе 18,75 мг/кг, начиная с острого периода патологии, способствует снижению интенсивности процессов некроза и апоптоза и восстанавливает функции поврежденных отделов спинного мозга.

2. Экспериментально обоснована возможность использования димефосфона для лечения больных с позвоночно-спинальной травмой контузионного характера.

Список литературы

1. А.Г. Баснакьян, А.В. Басков, Н.Н. Соколов, И.А. Борщенко, Вопросы медицинской химии, № 5, 431 – 443 (2000).

2. А.О. Визель, Р.С. Гараев, А.А. Муслинкин, И.А. Студенцова, Тера Медика, № 3, 34 – 35 (1998).

3. В.И. Данилов, И.А. Студенцова, Терра Медика, № 1, 34 – 35 (2000).

4. В.И. Данилов, В.П. Панкова, И.А. Студенцова, А.О. Визель, Нейрохирургия, № 2, 43 – 48 (2002).

5. И.В. Заиконникова, И.А. Студенцова, Авт. свид. СССР № 1291152 (1977).

6. И.Я. Раздольский, Многотомное руководство по хирургии, Т. 4, Медицина, Москва (1963).

7. И.А. Студенцова, В.И. Данилов, Р.Х. Хафизьянова, Казан. мед. журнал, Т. 76, № 5, 214–218 (1995).

8. A.R. Allen, J. Amer. med. Assoc., V. 9, 878–880 (1914).

9. E. Emery, P. Aldana, M.B. Bunge et al. J. Neurosurg.,V. 89, 911–920 (1998).

10. R.A. Lockshin, Z. Zakeri-Milovanovic, Cell agening and cell death (Eds. I. Devis, and D.C. Sigl.) Cambridge, 243 (1984).

11. J. Lou, L.G. Lenke, F.J. Ludwig, M.F. O'Brien, Spinal Cord, 10, 683–690 (1998).

12. C. Yong, P.M. Arnold, M.N. Zoubine et al. , J. Neurotrauma, V. 15, 459–472 (1998).

Иллюстрации:

Рисунок 1. Микрофотография срезов спинного мозга собак I группы на 10-й день после травмы спинного мозга. Шкала: А, В – 200 мкм; Б – 50 мкм; Г, Д – 20 мкм. Окраска гематоксилин-эозином. Стрелками указаны нейроны с признаками апоптоза в передних (Г) и задних (Д) рогах спинного мозга.

Рисунок 2. Микрофотография срезов спинного мозга собак II группы на 10-й день после травмы спинного мозга. Шкала: А, В – 200 мкм; Б – 50 мкм; Г, Д – 20 мкм. Окраска гематоксилин-эозином. Стрелками указаны нейроны передних (Г) и задних (Д) рогов спинного мозга.

Рисунок 3. Микрофотографии срезов спинного мозга собак II группы на 1-, 3-, 5- и 7-е сутки после травмы спинного мозга. Шкала: А-Г – 200 мкм. Окраска гематоксилин-эозином. Стрелками указаны субарахноидальные и субдуральные кровоизлияния в контузионной зоне на 1-е и 3-и сутки после травмы.