Биологические науки/9.Биохимия и биофизика

Бурко Д.В., Рымко А.Н.*, Кухарская Т.А., к.б.н. Квач С.В.,

д.б.н. Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

*Международный государственный университет им. А.Д.Сахарова, Минск

Иммобилизация диаденозинтетрафосфата включением в слоистый двойной гидроксид

В последнее время большое внимание уделяется разработке систем доставки лекарственных субстанций в клетки-мишени с использованием разнообразных наноразмерных материалов [1]. Среди кандидатов в переносчики лекарственных средств рассматриваются неорганические слоистые двойные гидроксиды (СДГ), из-за их низкой токсичности, высокой емкости и повышенной способности проникать в клетки [2].

По химической природе СДГ – класс анионных глин. Их структуру описывают в виде металл-гидроксидных слоев, в которых часть дивалентных катионов изоморфно замещена на катионы тривалентные, что приводит к возникновению на слоях положительных зарядов. Эти заряды компенсируются за счет интеркаляции гидратированных анионов в межслойное (галерейное) пространство.

СДГ редко встречаются в природе, но их можно легко синтезировать в лабораторных условиях путем прибавления основания к растворам, содержащим смесь двухвалентных и трехвалентных ионов. Природный аналог СДГ – Mg₆Al₂(OH)₁₆CO₃·4H₂O – содержит трехвалентные Al³⁺-катионы, расположенные в октаэдрическом слое Mg(OH)₂, в то время как CO₃^2--анионы занимают межслойное пространство. Получение СДГ, содержащих иные (кроме CO₃^2-) ионы, затруднено из-за очень высокой аффинности ионов CO₃^2-, которые неизменно присутствуют в растворе, образуясь из атмосферного СО₂. Это вынуждает проводить все синтезы в инертной атмосфере с тем, чтобы исключить возможность внедрения карбонат-ионов в целевой продукт.

В этой связи, следует отметь, что в работе [3] предложен метод получения нитратной формы СДГ (MgAl/NO₃-СДГ) при обычных атмосферных условиях. Синтез проводился методом копреципитации металлических ионов в присутствии гидроксида аммония. По мнению авторов, аммоний, комплексуясь с CO₃^2-, удерживает их в растворе и таким образом препятствует интеркаляции в межслойное пространство СДГ.

Было бы интересно использовать такой же подход к синтезу нанокомпозита СДГ, содержащего в галерейном слое фармакологически важное соединение – диаденозинтетрафосфат (Ap₄A). Информации о синтезе такого наноматериала нам найти не удалось.

Материалы и методы. Синтез Ар₄А осуществляли из АТР с помощью рекомбинантной лизил-тРНК-синтетазы Escherichia coli как описано нами ранее [4].

Нитратную форму СДГ (MgAl/NO₃-СДГ) синтезировали методом копреципитации, предложенным в работе [3]. К 0,05 М раствору NH₄OH при температуре 25°С и интенсивном перемешивании медленно, по каплям, добавляли раствор, содержащий нитраты магния (0,02 М) и алюминия (0,01 М). Полученную реакционную смесь, содержащую осадок MgAl/NO₃-СДГ, подвергали процедуре «старения» – оставляли при 25°С на ночь. Полученный осадок собирали центрифугированием (20 000 g, 10 мин), трижды отмывали водой, затем ацетоном и высушивали на воздухе при 60°С в течение 24 ч.

Просвечивающую электронную микроскопию осуществляли, используя микроскоп JEM-100CX. Образцы СДГ (до высушивания ацетоном) разводили водой, наносили на сетчатые никелевые мишени с нитроцеллюлозной подложкой и высушивали на воздухе в течение ночи [5].

Для синтеза СДГ, содержащих в межслоевом пространстве соединения нуклеиновой природы, в 0,05 М раствор NH₄OH вносили требуемое соединение («гость») до конечной концентрации 0,01 М. Дальнейшая процедура полностью повторяла описанную выше процедуру синтеза нитратной формы СДГ. Эффективность интеркаляции лигандов в состав СДГ оценивали путем спектрофотометрического (λ=260 нм) определения их концентрации в супернатанте и после разрушения известного количества целевого продукта с помощью 0,02 М HCl [6].

Термическую обработку СДГ проводили, используя вакуумный электрошкаф. Все образцы прогревали на воздухе при требуемой температуре в течение 1,5 ч, после чего их подвергали ТСХ на пластинках Silufol-UV₂₅₄ в системе растворителей диоксан–изопропанол–водный аммиак–вода (4:1:1:4). Продукты элюировали с пластин 0,05 М К-фосфатным буфером (рН 7,0) и определяли концентрацию, используя коэффициенты молярной экстинкции при 259 нм для АМР/АТР и Ар₄А, равные соответственно 15 400 и 30 800 М^-1.

Результаты и обсуждение. В настоящее время СДГ получают, как правило, одним из трех методов: 1) копреципитацией [7], 2) ионным обменом [8], 3) реконструкцией (регидратацией кальцинированных СДГ) [9]. Наиболее удобным считается метод копреципитации, предусматривающий прибавление основания к растворам, содержащим смесь двухвалентных и трехвалентных металлических катионов.

Относительно размеров частиц следует заметить, что, как известно, размер и морфология наночастиц СДГ зависят от условий их синтеза и химической природы галерейных (гостевых) молекул, причем механизм изменения морфологии в зависимости от состава СДГ еще не ясен.

На полученных нами микрофотографиях (рис. 1) частицы СДГ довольно гомогенны и имеют гексагональную или округлую форму. Размер их колеблется от 400 до 600 нм у MgAl/NO₃-СДГ, от 200 до 300 нм у MgAl/AMP-СДГ и от 100 до 200 нм у MgAl/Ap₄A-СДГ (не представлено).

(а) (б)

Рис. 1. Микрофотографии различных форм СДГ: (а) MgAl/NO₃-СДГ,

(б) MgAl/AMP-СДГ

Результаты типичного эксперимента по включению ряда соединений нуклеиновой природы в состав MgAl-СДГ представлены в табл. 1.

Таблица 1

Интеркаляция соединений нуклеиновой природы в MgAl-СДГ

Лиганд («гость»)	Связывание, %	Емкость, мкмоль лиганда/мг СДГ	Емкость, мг лиганда/мг СДГ
Аденин	–
Аденозин	–
AMP	65,8	1,44	0,5
ATP	36,5	0,79	0,38
Ap4A	32	0,83	0,64

Можно видеть, что в использованных экспериментальных условиях соединения, не содержащие отрицательно заряженных фосфатных групп, не включались в СДГ. Как и следовало ожидать, степень иммобилизации АТР и Ap₄A оказалась вдвое меньшей, чем этот показатель у АМР. Таким образом, определяющим является наличие у молекулы отрицательного заряда. С другой стороны, увеличение отрицательного заряда молекулы ведет к уменьшению количества включившихся молекул [6]. Это хорошо видно при сравнении количеств AMP и ATP (1,44 против 0,79 мкмоль/мг), которые включились в СДГ.

Необходимо подчеркнуть, что проведенная в специальном эксперименте с использованием ТСХ проверка инертности СДГ в отношении лигандов показала, что с молекулами соединений, включаемыми в СДГ, не происходит никаких структурных изменений.

Результаты экспериментов по полному термическому разложению АМР и Ар₄А в свободном состоянии и в составе СДГ отражены на рис. 2. Видно, что СДГ придают большую термоустойчивость включенным в них соединениям.

Рис. 2. Термическое разложение АМР и Ар₄А в свободном состоянии и в составе СДГ

Следует отметить, что эти данные совпадают с результатами, полученными в работе [8] для MgAl/AMP-СДГ, синтезированного методом ионного обмена в атмосфере азота.

Таким образом, в настоящей работе синтезированы наноразмерные СДГ, содержащие различными соединениями нуклеиновой природы, в том числе с Ap₄A – впервые. Показано, что СДГ не изменяют химическую структуру включенных в них соединений и придают им большую термостабильность.

Литература:

1. Larocque J., Bharali D.J., Mousa S.A. Cancer detection and treatment: the role of nanomedicines // Mol. Biotechnol. 2009. Vol. 42, № 3. P. 358–366.

2. Choi S.J., Oh J.M., Choy J.H. Anticancer drug-layered hydroxide nanohybrids as potent cancer chemotherapy agents // J. Phys. Chem. Solids. 2008. Vol. 69, № 5-6. P. 1528–1532.

3. Olanrewaju J., Newalkar B.L., Mancino C., Komarneni S. Simplified synthesis of nitrate form of layered double hydroxide // Mater. Lett. 2000. Vol. 45, № 6. P. 307–310.

4. Burko D.V., Kvach S.V., Zinchenko A.I. Application of Escherichia coli recombinant Lysyl-tRNA synthetase for the synthesis of diadenosine 5',5'''-P1,P4-tetraphosphate // Biotechnology: State of the Art and Prospects for Development / Ed. G.E. Zaikov. – NY: Nova Science Publishers, Inc. – 2008. – P. 31–37.

5. Tseng C.H., Hsueng H.D., Chen C.Y. Effect of reactive layered double hydroxides on the thermal and mechanical properties of LDHs/epoxy nanocomposites // Composit. Sci. Technol. – 2007. – Vol. 67. –P. 2350–2362.

6. Choy J.H., Oh J.M., Park M., Sohn K.M., Kim J.W. Inorganic-biomolecular hybrid nanomaterials as a genetic molecular code system // Adv. Mater. 2004. Vol. 16, № 14. P. 1181–1184.

7. Olfs H.W., Torres-Dorante L.O., Eckelt R., Kosslick H. Comparison of different synthesis routes for Mg–Al layered double hydroxides (LDH): Characterization of the structural phases and anion exchange properties // Appl. Clay Sci. 2009. Vol. 43, № 3–4. P. 459–464.

8. Aisawa S., Ohnuma Y., Hirose K., Takahashi S., Hirahara H., Narita E. Intercalation of nucleotides into layered double hydroxides by ion-exchange reaction // Appl. Clay Sci. 2005. Vol. 28, № 1–4. P. 137–145.

9. Aisawa S., Hirahara H., Ishiyama K., Ogasawara W., Umetsu Y., Narita E. Sugar–anionic clay composite materials: intercalation of pentoses in layered double hydroxide // J. Solid State Chem. 2003. Vol. 174, № 2. P. 342–348.