Биологические науки/6.Микробиология

Квач С.В.¹, Ерошевская Л.А.¹, Шахбазов А.В.², Картель Н.А.², Зинченко А.И.¹

1-Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

2-Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, Минск

ПОЛУЧЕНИЕ И ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНОЙ УРИДИНФОСФОРИЛАЗЫ ESCHERICHIA COLI

Как известно, ключевой стадией синтеза модифицированных нуклеозидов является присоединение гетероциклического основания к активированному остатку сахара – гликозилирование. Часто эту стадию осуществляют с помощью ферментов – нуклеозидфосфорилаз [1–3]. Нуклеозидфосфорилазы E. coli представлены тремя внутриклеточными ферментами: уридин-фосфорилазой (УРФазой) и тимидинфосфорилазой, использующими в качестве субстратов пиримидиновые нуклеозиды, и пуриннуклеозид-фосфорилазой, субстратами которой являются пуриновые нуклеозиды.

Применение стандартных методов очистки (осаждение сульфатом аммония, хроматография на ионообменных смолах, гель-проникающая хроматография и т.д.) достаточно трудоемки и приводят к высоким потерям целевых белков [4]. В тоже время рекомбинантные технологии дают возможность получать химерные белки, несущих на С- или N-концах дополнительные пептиды, позволяющие использовать для очистки рекомбинантных белков аффинную хроматографию. Среди таких пептидов наибольшее распространение получил полигистидиновый олигопептид, состоящий из 6–10 остатков гистидина и обеспечивающий аффинность к ионам двухвалентных металлов (Ni²⁺, Cu²⁺, Co²⁺).

Целью данной работы было создание штамма-суперпродуцента рекомбинантной УРФазы, несущей на С-конце полигистидиновый олигопептид и ее очистка.

Материалы и методы. Ген udp, кодирующий УРФазу, был выделен методом ПЦР с использованием в качестве матрицы геномной ДНК штамма E. coli БМТ-4Д/1а [5]. Для амплификации гена udp использовали следующую пару праймеров: UDP-F (5′-CGTAAGCATATGTCCAAGTCTGATGTTTTT-CATCTCG-3′) и UDP-R (5′-ACTCGAGCAGCAGACGACG-CGCCGC-3′). В 5′-окончания праймеров были встроены сайты рестрикции (выделены курсивом) эндонуклеаз NdeI (UDP-F) и XhoI (UDP-R). Для проведения реакции амплификации использовали 1 ед. активности Fusion HF-полимеразы (New England Biolab, США). Синтезированный продукт выделяли из геля, обрабатывали смесью рестриктаз NdeI и XhoI, и полученную вставку с геном udp лигировали в вектор pET24b+, содержащий T7-промотор и полигистидиновый олигопептид на С-конце (Novagen, США). В результате была сконструирована плазмида pETUDP17. Этим вектором трансформировали клетки E. coli BL21(DE3) с получением штамма, обозначенного E. coli pUDP17.

Клетки E. coli pUDP17 выращивали на LB-среде, содержащей 50 мкг/мл канамицина, до оптической плотности 0,6 (λ = 600 нм); затем проводили индукцию синтеза белка путем внесения изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG) до концентрации 1 мМ и продолжали культивирование в течение 3 ч. По окончании культивирования клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 5000 g. Осадок клеток ресуспендировали в лизирующем буфере, содержащем 50 мМ NaH₂PO₄, 300 мМ NaCl и 20 мМ имидазол (рН 8,0). Ультразвуковую дезинтеграцию клеток осуществляли, используя режимы: мощность 0,5 кВт, температура 4^оС, продолжительность 5 мин.

После центрифугирования образца при 20000 g в течение 30 мин супернатант наносили на хроматографическую колонку со смолой Ni-NTA (“Qiagen”, США). Колонку промывали буфером, содержащим 20 мМ Трис-HCl, 0,5 М NaCl и 20 мМ имидазол (рН 7,9). Белок элюировали буфером «B», содержащим 20 мМ Трис-HCl, 0,5 М NaCl и 1 М имидазол (рН 7,9). Раствор белка подвергали диализу против 1000-кратного объема 10 мМ К-фосфатного буфера (рН 6,4), содержащего 1 мМ EDTA и 2 мМ β-меркаптоэтанол.

Активность УРФазы определяли спектрофотометрически по изменению поглощения при распаде уридина до урацила (λ=290 нм) [3]. За единицу активности УРФазы принимали такое её количество, которое обеспечивало образование 1 мкмоль продукта за 1 мин в условиях проведения реакции.

Результаты и обсуждение. В настоящей работе создана конструкция, состоящая из гена udp, встроенного в вектор pET24b+. В результате ген УРФазы поставлен под контроль Т7-промотора, а на С-конце имеет последовательность, кодирующую шестигистидиновый олигопептид. Этой плазмидой трансформировали клетки E. coli BL21(DE3), предназначенные для экспрессии белка, находящегося под контролем T7-промотора.

У полученного штамма (E. coli pUD17) была проведена индукция синтеза УРФазы в рекомендуемых условиях с использованием IPTG в концентрации 1 мМ. Результаты этого эксперимента представлены на рис. 1.

Из рис. 1 видно, что максимальная активность УРФазы (63 ед/мг) наблюдается при индукции в течение 3-х час. При дальнейшем культивировании активность УРФазы незначительно падает (до 61 ед/мг на 4-й час индукции). Таким образом, оптимальными условиями культивирования для получения максимальной активности УРФазы в штамме E. coli pUDP17 являются: культивирование бактерий при 37^oС в течение 3-х час после индукции 1 мМ IPTG.

Далее, проводили препаративное выращивание клеток штамма E. coli pUDP17 и очистку УРФазы с использованием металлоаффинной хроматографии. Результаты эксперимента суммированы в табл. 1.

Таблица 1

Выделение и очистка УРФазы

Стадия	Общая активность, ед	Общий белок, мг	Удельная активность ед/мг	Степень очистки	Выход, %
1. Ультразвуковая дезинтеграция клеток	4 025	35	115	1	100
2. Выделение на смоле Ni-NTA и диализ	3 410	16	213	1,9	84,8

Визуально чистоту полученного ферментного препарата контролировали с помощью полиакриламидного SDS-электрофореза (рис. 2).

Из электрофореграммы видно, что в исходном лизате основную массу наработанного белка составляет целевой белок. Однако при очистке белка методом металлоаффинной хроматографии некоторое количество УРФазы не связалось со смолой, что может быть связано с недостатком емкости сорбента. После диализа получен белок с высокой степенью чистоты.

Из табл. 1 видно, что в результате использованного нами подхода получен препарат фермента УРФазы, очищенной в 1,9 раза с сохранением 84,8% исходной активности. Данный ферментнай препарат может быть использован для постановки реакций трансгликозилирования с целью получения широкого спектра фармакологически важных нуклеозидов.

Литература:

1. Mikhailopulo, I.A. Biotechnology of nucleic acid constituents – state of the art and perspectives / I.A. Mikhailopulo // Curr. Org. Chem.– 2007. – Vol. 11, № 4. –Р. 317–335.

2. Immobilized biocatalysts for the production of nucleosides and nucleoside analogues by enzymatic transglycosylation reactions / G. Zuffi [et al.] // Biocatal. Biotransform. – 2004. – Vol. 22. – № 1. – P. 25–33.

3. Krenitsky, T.A. Purine nucleoside synthesis, an efficient method employing nucleoside phosphorylase / T.A. Krenitsky, G.W. Koszalka, J.V. Tuttle // Biochemistry. – 1981. – Vol. 20, № 12. – P. 3615–3621.

4. Overexpression of Escherichia coli genes encoding nucleoside phosphorylases in the pET/BL21(DES) system yields active recombinant enzymes / R.S. Esipov [et al.] // Protein Expr. Purif. –2002. –Vol. 24, № 1. –P. 56–60.

5. An universal biocatalyst for the preparation of base- and sugar-modified nucleosides via an enzymatic transglycosylation / V.N. Barai [et al.] // Helvetica Chim. Acta. –2002. –Vol. 85, № 7. –Р. 1901–1908.