Д.м.н. Кувшинов Д.Ю., к.фарм.н. Сухих А.С.

Кемеровская государственная медицинская академия, Россия

Возможности высокоэффективной жидкостной хроматографии для поиска биохимических маркеров в конденсате альвеолярного воздуха и в слюне

В настоящее время большое значение приобрела высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) – один из эффективных методов разделения сложных смесей веществ, широко применяемый как в аналитической химии. Основой хроматографического разделения является участие компонентов разделяемой смеси в сложной системе. С помощью ВЭЖХ возможен поиск биохимических маркеров в конденсате альвеолярного воздуха и в слюне.

На базе Центральной научно-исследовательской лаборатории КемГМА проведен пилотный ВЭЖХ-анализ образцов конденсата альвеолярного воздуха и слюны. Исследование выполнено на приборе ВЭЖХ-хроматограф Цвет Яуза-04 (НПО Химавтоматика, Россия) с УФ и амперометрическим детектором. Управление прибором и обработка полученных результатов осуществлялась с использованием программного обеспечения МультиХром, версия 3.1.1550 (ЗАО Амперсенд, Россия). Объем петли 100 мкл. Скорость потока 0,1 мл/мин., давление 25,5+1 bar. Колонка: Gemini 5 мкм C18, 110A Размер 250х4,6 мм (Phenomenex). Подвижная фаза: Ацетонитрил - Изопропиловый спирт - вода (в соотношении 35:1:64) с добавлением кислоты лимонной. В работе применялся Ацетонитрил сорт 0 осч УФ поглощение на 200 нм (ВЭЖХ против воды) 0,012 о.е./см (НПК Криохром, Россия). Смешав с подвижной фазой 1:1 анализируемый образец пропустили через фильтр Amprep. Ниже приведены типичные хроматограммы исследуемых образцов.

Рис. 1. Хроматограмма образца слюны. Амперометрическое детектирование

Рис. 2. Хроматограмма образца слюны. УФ детектирование на 255нм.

Рис. 3. Хроматограмма образца слюны. УФ детектирование на 280нм.

Как видно, на приведенном примере на рис. 1, 2, 3 приведены хроматограммы образца слюны. Амперометрическое детектирование позволяет определить до двадцати разделяемых компонентов. Детектирование в УФ – области на длинах волн 255 и 280 позволяют определять вещества, содержащие в своей структуре поглощающий хромофор. Используя метчики, были определены лизоцим, аденозин. Показано содержание стероидоподобной структуры, принадлежность которой требует дополнительных исследований. Используя амперометрическое детектирование возможно определение количественного содержания не только низкомолекулярных компонентов образца, но также некоторых типов олигомеров и пептидов.

Рис. 4. Хроматограмма образца конденсата выдыхаемого воздуха. Амперометрическое детектирование

Рис. 5. Хроматограмма образца конденсата выдыхаемого воздуха УФ детекция на 255нм

Рис. 6. Хроматограмма образца конденсата выдыхаемого воздуха УФ детекция на 280нм.

Исходя из полученных данных, применение амперометрического детектора характеризуется высокой чувствительностью. Использование нескольких типов детекторов повышает информативность полученных результатов при анализе биологических жидкостей. Таким образом, можно говорить не только принципиальной возможности анализа данных биологических жидкостей методом ВЭЖХ-хроматографии, но и о перспективе выявления ранее невыявляемых методами традиционного биохимического анализа маркеров высокой стрессреактивности и предикторов роста артериального давления.

Исследование выполнено при поддержке гранта Губернатора Кемеровской области А.Г. Тулеева для молодых ученых – докторов наук.