Добротина Н.А., Ладыгина Г.Н., Речкин А.И., Евтеева Н.И.

Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского

Микробиологический алгоритм работы с бактериальными эндоспорами для дальнейшей их дезинфекции

Спорообразующие микроорганизмы – это гетерогенная группа, относящаяся к широко распространенным родам. Основными классифицирующими критериями выступают способность к спорообразованию и микроморфология. Работа со спорами является частью нанобиотехнологии, которая рассматривается как приоритетное направление. За счет высокой термо- и химиорезистентности спор эти виды спорообразующих микроорганизмов привлекают большое внимание. Особое значение представляет Bacillus anthracis. Сибирская язва – антропозооноз, который ранее встречался у человека как профессиональное заболевание (контактная язва) и целенаправленно изучалось в ветеринарии. В связи с экологической агрессией на человека, возможными изменениями реактивности и иммунитета в настоящее время произошел патоморфоз многих заболеваний, в том числе инфекций, т.е. изменение формы и патогенеза болезни. У человека, особенно при массивном инфицировании, возможна кишечная и септическая форма с высокой летальностью. Именно поэтому, а также в связи с биологическим терроризмом (споры) и микробиологической неграмотностью (проблема многочисленных могильников) изучение спорообразующих моделей является исключительно актуальным.

Целью настоящей работы явилась разработка алгоритма и создание модели на примере грамположительных спорообразующих и грамотрицательных цистообразующих бактерий для последующей дезинфекции. Были подобраны природные почвенные бактерии Azotobacter chroococcum, Bacillus subtilis и Bacillus megaterium, выделенные из различных почв, растений и другого природного материала.

В процессе работы разработан алгоритм выделения, идентификации чистых культур. Произведен подбор оптимальных сред для цисто- и спорообразования, самым удобным и обоснованным для использования явился картофельный агар и среда Эшби.

- Проведена комплексная оценка ключевых физиолого-биохимических, культуральных и морфологических признаков выделенных штаммов спорообразующих и цистообразующих бактерий.

- Подобраны питательные среды для массивного спорообразования охарактеризованных штаммов.

- Разработан алгоритм накопления и консервирования споровой массы.

- Проведен мониторинг сохранения жизнеспособности спор и цист в процессе длительного хранения в 1% NaCl при +4 °C.

- Разработан алгоритм количественной оценки жизнеспособности спор и цист в процессе хранения.

Спорообразующие микроорганизмы более устойчивы к действию различных дезинфицирующих факторов, однако и здесь существует колоссальное видовое и внутривидовое, типовое биоразнообразие. По шкале сравнительной устойчивости к дезинфицирующим средствам бактериальные эндоспоры относятся к высокой степени устойчивости. За последние десятилетия резко возросла устойчивость микроорганизмов к дезинфицирующим средствам, причем это касается не только патогенных и госпитальных штаммов, но и микроорганизмов, выделенных из природной среды. Такое возрастание резистентности микроорганизмов обнаружено к общепринятым дезинфектантам – кислородосодержащим, альдегидосодержащим, хлорсодержащим, третичным аминам, гуанидинам и тд. Уничтожение всех вегетативных клеток и части спор относится к дезинфекции высокого уровня. В настоящее время она осуществляется жидкими спороцидными химикатами при кратковременной экспозиции – альдегиды, ортофталевый альдегид, перекись водорода, надуксусная кислота. Таким образом, ни одна из групп дезинфектантов не является абсолютно эффективной, что имеет прямое отношение и к спорообразующим микроорганизмам. В связи с этим необходим поиск нового поколения дезинфицирующих средств.

Нами было апробировано дезинфицирующее средство нового поколения «Альфадез форте», содержащее в качестве действующих веществ комплекс четвертичных аммониевых соединений: бензалконии хлорид и дидецилдиметил аммоний хлорид, глиоксаль и вспомогательные компоненты. Эффект действия оценивался на споровой массе штаммов Bacillus subtilis и Bacillus megaterium и на массе цист Azotobacter chroococcum. Был использован рабочий раствор исследуемого препарата (инструкция №7-3/06, 2006), из которого готовились десятикратные разведения от 10^-1 до 10^-6. Таким образом, степень концентрации опытного варианта дезинфектанта была значительно ниже рабочего раствора. Из каждого разведения по 0,05 мл средства вносили в 0,05 мл суспензии споровой массы, приготовленной по стандарту мутности 10 ед., и встряхивали на качалке в течении 10 минут. После отмывания осадка споровой массы по 0,05 мл высевали сплошным газоном на МПА и среду Эшби, культивировали в термостате при 28°C сутки. Контролем служил посев 0,05 мл споровой массы без добавления дезинфектанта. Оценка эффекта воздействия препарата «Альфадез форте» производилась сравнением количества выросших колоний в опытном и контрольном вариантах. На представленной модели – бациллярная споровая масса гр+ бактерий, масса цист гр- показана высокая эффективность апробированного дезинфицирующего средства – рост бацилл и рост азотобактера в опытных вариантах полностью отсутствует.

В настоящее время исключительную актуальность приобретает проблема биологической, в том числе микробиологической, эпидемиологической безопасности и биологического терроризма (споры). Нами обсуждается возможность использования малых поглощенных доз радиации для действия на споры (вышепредставленная модель). Особый интерес представляет комплексное воздействие малых поглощенных доз и различных физических факторов (t, влажность) на споры (г.Саров, МНТЦ). Данные исследования могут быть применены для разработки санации закрытых помещений.

Работа выполнена в рамках проекта МНТЦ №3116.