Київський національний університет імені
Тараса Шевченка
Визначення активності аденілатциклази,
гуанілатциклази та фосфодіестерази циклічних нуклеотидів у тканинах селезінки,
тимусу, пухлини щурів до і після опромінення
Дослідження молекулярних механізмів трансдукції сигналів у клітинах різного
походження за умов злоякісного росту та променевої терапії для з’ясування їх
ролі в цих процесах є актуальним напрямом сучасної науки. Аденілат- та
гуанілатциклази, а також фосфодіестерази цГМФ та цАМФ є ключовими ферментами сигнальної
системи циклічних нуклеотидів. Відомо, що з порушенням їх функціонування
пов’язаний розвиток цілого ряду патологічних процесів [3]. З’ясовано, що
променева терапія викликає порушення функціонування системи циклічних
нуклеотидів, змінює прийом і переробку клітинами поступаючих до них
гормональних сигналів. Проте радіаційно-індуковані порушення функціонування
системи циклічних нуклеотидів зумовлені не тільки змінами стаціонарних
концентрацій цГМФ і цАМФ, а і змінами активності ферментів, які контролюють їх
внутрішньоклітинний рівень: аденілатциклази (АЦ), гуанілатциклази (ГЦ) і
фосфодіестерази (ФДЕ) циклічних
нуклеотидів.
Метою даної роботи було з’ясування молекулярних механізмів трансдукції
сигналів у клітинах різного походження при розвитку карциноми Герена,
локальному рентгенівському опроміненні тварин у терапевтичних дозах.
В дослідах використовували білих лабораторних щурів-самців масою 130±10 г,
(розведення віварію УНДІОР), яких утримували на стандартному раціоні віварію.
Тваринам трансплантували карциному Герена шляхом підшкірної ін’єкції у ділянку
стегна задньої кінцівки 20%-ної суспензії пухлинних клітин на 0,9%-му розчині
NaCI, отриманих від щура-донора за методикою [1].
Пухлину на 8-му добу після прищеплення піддавали локальному рентгенівському
опроміненню в терапевтичних дозах на апараті РУМ-17 за таких
умов: напруга - 180 кВ,
сила струму - 10 мА,
фільтри - 0,5 мм
Cu +1,0 мм Al, потужність дози - 123 Р/хв, шкірно-фокусна відстань - 25 см. Тварин
декапітували через 1, 3 та 7 діб після опромінення. Активність ферментів
визначали в цитозольній фракції клітин, активність ФДЕ визначали використовуючи
методом тонкошарової хроматографії на пластинках Silufol [2]. Активність
ГЦ визначали за методом послідовної хроматографії на колонках Аl2О3
і Dawex, використовуючи рекомендації [4]. Визначення активності АЦ проводили як рекомендовано
в роботі [5]. Експериментальні дані обробляли загальноприйнятими методами
статистики.
В результатах, наведених в таблиці, показано
зменшення активності аденілатциклази особливо у селезінці та пухлині порівняно
з контролем як при злоякісному рості, так і на фоні опромінення. Активність
гуанілатциклази збільшувалась у всі терміни після опромінення: у тимусі її
рівень був максимальним на 3 добу (зростання у 2 рази), у пухлині Ї на 7 добу
(зростання в 2,5 рази). У селезінці активність цього ферменту підвищувалась з
максимумом на 3 добу після опромінення (в 1,3 рази) порівняно з контролем.
Опромінення впливало неістотно на активність
фосфодіестерази цАМФ, із незначними коливаннями в залежності від терміну дії та
тканини, що досліджувалась (табл.).
Зміни активності ФДЕ цГМФ як
за пухлинного процесу, так і за дії опромінення, були схожими: у селезінці її
значення суттєво не відрізнялись від контролю, у тимусі Ї зменшувалися в усі
терміни дослідження, а в пухлині Ї зменшувалися у 1,5 рази (табл.).
Отримані дані корелюють із змінами рівню циклічних
нуклеотидів у досліджуваних органах за умов розвитку пухлинного процесу та
опромінення. Можна припустити, що падіння рівню цАМФ у селезінці, тимусі й
пухлині щурів є результатом пригнічення активності ферменту їх синтезу Ї
аденілатциклази, а зростання рівня цГМФ Ї результатом стимуляції
гуанілатциклази, що є найбільш вираженим у лімфоїдних органах. Оскільки зміни
активності ФДЕ цАМФ та цГМФ за умов опромінення та злоякісного росту були
різноспрямованими та статично не значимими, ми припустили, що зміни рівню
циклічних нуклеотидів відбувалися в результаті дії АЦ та ГЦ, а не ФДЕ.
Таблиця
Активність
аденілатциклази (АЦ), гуанілатциклази (ГЦ) [пмоль/хв·мг білка],
фосфодіестераз(ФДЕ) цГМФ і цАМФ у
тканинах селезінки, тимусу, пухлини щурів до і після опромінення пухлини (М±m;
n=3-5)
|
Орган |
Експериментальний стан |
АЦ |
ГЦ |
ФДЕ |
|
|
цАМФ |
цГМФ |
||||
|
Селезінка |
контроль (інтактні щури) |
24,1 ± 3,8 |
1,6 ± 0,2 |
334,0 ± 31,6 |
0,68 ± 0,2 |
|
|
8 доб. після прищеплення |
28,1± 2,5 |
1,8 ± 0,3 |
240 ± 16,5* |
0,4 ± 0,2 |
|
|
1 доб. після опромінення |
12,6± 2,1 |
2,3 ± 0,3* |
280 ± 16,4* |
0,38 ± 0,2 |
|
|
3 доб. після опромінення |
14,1± 3,2 |
2,2 ± 0,2 |
260 ± 15,0* |
0,42 ± 0,3 |
|
|
7 доб. після опромінення |
21,0±2,3* |
1,9 ± 0,4 |
290 ± 20,5 |
0,73 ± 0,3 |
|
Тимус |
контроль (інтактні щури) |
8,2 ± 1,2 |
1,1 ± 0,1 |
240 ± 25,3 |
0,73 ± 0,1 |
|
|
8 доб. після прищеплення |
7,5 ± 1,5 |
1,5 ± 0,2* |
220 ± 11,8 |
0,5 ± 0,1* |
|
|
1 доб. після опромінення |
6,5± 1,8 |
2,1 ± 0,2* |
260 ± 11,8* |
0,5 ± 0,2 |
|
|
3 доб. після опромінення |
6,2± 2,1 |
2,4 ± 0,1* |
240 ± 11,2* |
0,68 ± 0,2 |
|
|
7 доб. після опромінення |
7,5± 2,8 |
1,8 ± 0,5 |
250 ± 15,1 |
0,54 ± 0,3 |
|
Пухлина |
8 доб. після прищеплення |
8,4 ± 2,3* |
0,98±0,15 |
220 ± 12,8 |
0,9 ± 0,2* |
|
|
1 доб. після опромінення |
6,8 ± 2,1 |
2,25±0,2* |
205 ± 10,1 |
1,15 ± 0,3 |
|
|
3 доб. після опромінення |
5,8 ± 1,8 |
2,8 ± 0,2* |
295 ± 15,8* |
1,1 ± 0,2 |
|
|
7 доб. після опромінення |
5,6 ± 2,1 |
2,95 ± 0,2 |
201 ± 10,1* |
0,85 ± 0,2 |
*- р£ 0,05
порівняно з контролем.
Отримані нами дані повністю узгоджуються з
результатами інших авторів щодо пострадіаційних змін рівнів циклічних
нуклеотидів [6].
У цілому ряді попередніх робіт було експериментальнo
показано, що уже в ранній період післяпроменевого ураження змінюється
стаціонарний рівень цГМФ і цАМФ, а саме, після впливу іонізуючої радіації
відбувається поступове, залежне від часу зниження цАМФ і незначне зростання
цГМФ. У подальші терміни досліджень опромінення зменшення вмісту цАМФ
прогресувало, а концентрація цГМФ незначно знижувалась, що співвідносилось
з [6].
Вивчення процесів,
що регулюються системою циклічних нуклеотидів за умов дії іонізуючої радіації,
давно привертають увагу дослідників. Показано, що опромінення організму в
летальних і надлетальних дозах, а також у дозах радіації, які викликають гостру
променеву хворобу, призводило до зниження рівня цАМФ та підвищення концентрації
цГМФ у початковий період після дії іонізуючого випромінювання.
Можна припустити, що порушення функціонування систем
цГМФ і цАМФ після впливу радіації може бути наслідком структурних і
функціональних змін тих ферментів, активність яких контролює і метаболіти, що
ми спостерігали при дослідженні пострадіаційних змін активності гуанілат- та
аденілатциклазами. Крім цього, подібність характеру виявлених змін в активності
цих ферментів може свідчити про однакові механізми ураження каскадів цАМФ та
цГМФ внаслідок дії іонізуючого випромінювання на тварин.
Висновки.
Таким чином, іонізуюча радіація викликає порушення функціонування системи
циклічних нуклеотидів, що може призвести до зміни прийому і переробки клітинами
поступаючих до них гормональних сигналів. Радіаційне ураження цієї системи
виявляється у зміні стаціонарних концентрацій цГМФ і цАМФ, що є наслідком змін
активності ферментів, які контролюють їх внутрішньоклітинний рівень: аденілат-
та гуанілатциклази.
Список
літератури. 1. Барабой В.А., Орел В.Э., Карнаух И.М.
Пероксидное окиснение и радиация. - К.: Наук. думка, 1991. 2. Лазаревич В.Г., Меньшиков М.Ю.,
Ткачук В.А. Характеристика
двух форм фосфодіэстераз циклических нуклеотидов и Са2+-зависемого
белкового регулятора в скелетны мышцах кролика // Биохимия. – 1979. - №10 –
С.1842-1852. 3. Остапченко Л.И. Роль автофосфорилирования в регуляции активности
сАМР-зависимых протеинкиназ из лимфоцитов селезёнки крыс в условиях воздействия
ионизирующей радиации // Укр. биохим. журн. – 1997. – Т. 69, № 1. - С.70-74. 4. Nakasava
A., Sano M., Saito T. Subcellucal distribution and
properties of guanilate cyclase in rat cerebellum // Biochim. et biofis. Acta.
– 1976.-V.444, № 2. Р.
563-570. 5. White A., Zenser T.
Saparation of cyclic 3’,5’-nucleoside monophosphates from other nucleotides on
aluminum oxide colums. Application to the assay of adenyl cyclase and guanyl
cyclase // Anal. Biochem.- 1974.- V.41, № 2. – Р.372-396. 6. Van
der Maazen K.W., Van der Kogel A.J. Radiosensitivity of rat glial stem cells
in vitro // Int. J. Radiat. Biol. - 1990. – Vol.58, №6. - P.1048-1049.