Медицина/ 6. Экспериментальная и клиническая фармакология

к. фарм. н. Щокіна К.Г., д. мед. н. Штриголь С.Ю., д. мед. н. Дроговоз С.М.

Національний фармацевтичний університет, Україна

Оцінка фрігопротекторної активності та впливу на рівень інтерлейкіну-1 в умовах гострого переохолодження рекомбінантного рецепторного антагоніста

Підвищення холодової резистентності є одним з найменш вивчених напрямків фармакології, тому створення препаратів із фрігопротекторною дією є актуальним завданням [5, 9, 11, 13, 14, 18, 19]. Сьогодні набуває розвитку перспективний напрямок досліджень, пов`язаний із вивченням цитокінових механізмів у розвитку різних патологічних станів, зокрема, вивчення цитокінового профілю при гострій холодовій травмі [7, 8, 20]. Визначення вмісту інтерлейкіну-1 (ІЛ-1) є цінним при діагностиці холодових пошкоджень [1, 10, 16]. У наших попередніх дослідженнях доведено, що антагоніст рецепторів інтерлейкіну-1 (АРІЛ-1) здатний підвищувати холодову резистентність [17]. Мета даної роботи – визначення можливого зв`язку між змінами вмісту ІЛ-1 та фрігопротекторною дією рекомбінантного антагоністу рецепторів ІЛ-1. Використано АРІЛ-1, отриманий у Санкт-Петербурзькому НДІ ОЧБП (Росія).

Фрігопротекторну дію АРІЛ-1 вивчали на білих мишах-самцях масою 16-21 г в співставленні з препаратом порівняння ацетилсаліциловою кислотою (АсК) [12] на моделі загального охолодження, для відтворення якої тварин вміщували до прозорої морозильної камери з постійною температурою –18^оС [2, 4]. Під час охолодження кожна тварина знаходились в індивідуальному пластиковому пеналі ємністю 1 дм³, спостереження за станом мишей відбувалось постійно.

У першій дослідів визначали ефективність досліджуваних препаратів при введенні в профілактичному режимі (за 30 хв. до охолодження). АРІЛ-1 вводили підшкірно в дозах 3 мг/кг та 15 мг/кг, АсК - внутрішньошлунково в дозі 25 мг/кг. Доза АРІЛ-1 3 мг/кг є умовно-терапевтичною за протизапальним ефектом, 15 мг/кг – умовно-терапевтичною за психо- та нейропротекторною дією [6, 15]. Фрігопротекторну активність оцінювали за часом виживання мишей (до агонального вдиху) в умовах гострого охолодження за формулою:

T_s

A_fp = –––– × 100%,

T_sс

де A_fp – фрігпротекторна активність, %; T_s – середня тривалість життя в групі досліджуваного препарату, хв.; T_sс – середня тривалість життя в групі контрольної патології, хв.

У другій серії дослідів АРІЛ-1 та АсК вводили у профілактичному режимі в дозах 3 мг/кг та 25 мг/кг. Через 30 хв після введення препаратів тварин вміщували, як зазначено вище, до морозильної камери при –18 ^оС на 30 хв. Цей термін холодового впливу не спричиняє смертельних наслідків, але суттєво погіршує загальний стан мишей. Через 20 хв після завершення загального охолодження тварин декапітували та визначали ІЛ-1 у крові методом імуноферментного аналізу з використанням набору виробництва «Біоконтур» (Санкт-Петербург, Росія) на аналізаторі STATE FAX (США).

У третій серії дослідів визначали вплив АРІЛ-1 при введенні в профілактичному та лікувальному режимах на перебіг початкового відновлювального періоду після загального гострого охолодження. Для цього тварин вміщували, як зазначено вище, до морозильної камери при –18 ^оС на 30 хв. Після завершення холодової експозиції миші знаходились при температурі +21-22 ^оС, подальші дослідження починали через 20 хв. Спочатку визначали локомоторну, дослідницьку активність і вегетативний супровід емоційних реакцій у тесті відкритого поля, м’язовий тонус і координацію рухів – за кількістю мишей, що за певні проміжки часу впали зі стрижня діаметром 2 см, який обертається зі швидкістю 10 об/хв. [3].

На заключному етапі дослідження оцінювали фізичну витривалість за тестом примусового плавання з навантаженням. Мишей із вантажем (15% від маси тіла на корені хвоста) вміщували в басейн з водою кімнатної температури (+21-22 ^оС) та реєстрували час плавання. Критерієм виснаження було знаходження тварини під водою з неспроможністю спливти на поверхню протягом 10 с.

Достовірність відмінностей у разі обліку результатів як «середня ± стандартна помилка» розраховували за критерієм t Ст’юдента, при їх реєстрації в альтернативній формі – за кутовим перетворенням Фішера.

Результати дослідження наведені в табл. 1-5.

Таблиця 1

Вплив АРІЛ-1 та ацетилсаліцилової кислоти на час життя мишей

в умовах гострого загального охолодження (–18 ^оС)

Група тварин	Кількість тварин, n	Час виживання, хв.	Фрігопротекторна активність, %
Контрольна патологія	9	51,9±4,4	–
АРІЛ-1, 3 мг/кг	6	99,5±11,9*	91,7
АРІЛ-1, 15 мг/кг	6	92,5±12,9*	78,2
Ацетилсаліцилова кислота, 25 мг/кг	5	81,0±3,1*	56,1

Примітка: * – достовірні відмінності з групою контрольної патології (р ≤ 0,05).

Аналіз даних табл. 1 свідчить, що АРІЛ-1 в обох дозах сприяв достовірному збільшенню часу життя експериментальних тварин порівняно з групою контрольної патології. Фрігопротекторна активність АРІЛ-1 склала 91,7% для дози 3 мг/кг та 78,2 для дози 15 мг/кг, що перевершує фрігопротекторну активність АсК в 1,6 раза та 1,4 раза відповідно. Для подальших досліджень обрано дозу 3 мг/кг.

Таблиця 2

Вплив АРІЛ-1 на вміст інтерлейкіну-1 у крові мишей

після загального охолодження

Группа тварин	Вміст інтерлейкіну-1, пкг/мл
Інтактний контроль, n=6	88,33±10,51
Контрольна патологія, n=6	146,92±12,13*
АРІЛ-1, 3 мг/кг, n=6	96,64±11,95^#
АсК, 25 мг/кг, n=7	124,91±18,10

Примітка: * – достовірні відмінності з групою інтактного контролю (р ≤ 0,05), ^# – з групою контрольної патології (р ≤ 0,05).

Після гострого загального охолодження вміст ІЛ-1 в крові тварин групи контрольної патології збільшився на 66,3% порівняно з показником у інтактних тварин (табл. 2). На тлі АРІЛ-1 вміст ІЛ-1 нормалізувався і перевершував рівень інтактних тварин лише на 9,4%. АсК, на відміну від АРІЛ-1, майже не впливала на вміст ІЛ-1, рівень якого залишався збільшеним на 41,4%. Це дозволяє оцінити роль ІЛ-1 у розвитку порушень, викликаних переохолодженням, та визначити механізм фрігопротекторної дії АРІЛ-1.

Таблиця 3

Вплив АРІЛ-1 на поведінку мишей у тесті відкритого поля через 20-30 хв.

після гострого загального охолодження

Показники	Інтактний контроль (n=15)	Контрольна патологія (n=11)	АРІЛ-1, 3 мг/кг
			профілактичний режим (n=7)	лікувальний режим (n=7)
Рухова активність: – перетнуто квадратів – вертикальних стійок	31,3±6,1 7,6±1,5	4,0±1,2* 0,4±0,3*	18,4±2,9*^# 1,7±0,7*	20,7±6,0^# 2,6±1,7*
Дослідницька активність (обстежено отворів)	30,1±2,7	5,4±1,8*	9,8±1,7*	10,3±2,7*
Емоційні та вегетативні реакції: – грумінг – фекальні болюси – уринації – сума показників	1,1±0,5 0,1±0,1 0 1,3±0,9	0,2±0,2 0 0 0,2±0,2	0,9±0,3^# 0 0 0,9±0,3	0,7±0,3 0 0 0,7±0,3
Сума всіх активностей	70,0±7,8	10,0±2,6*	30,0±4,7*^#	34,3±9,2*^#

Примітка: * – достовірні відмінності з групою інтактного контролю (р ≤ 0,05), ^# – з групою контрольної патології (р ≤ 0,05).

Дані табл. 4 свідчать, що охолодження спричинило достовірне зниження тонусу скелетних м`язів та погіршення координації рухів тварин групи контрольної патології порівняно з інтактними (не втрималися на стрижні до 30 с відповідно 90,9% та 46,7% мишей, понад 30 с – 9,1% та 53,3%). АРІЛ-1 за обох режимів уведення сприяв збільшенню часу втримання тварин на стрижні (до 30 с – 71,4% мишей при профілактичному та 85,7% при лікувальному введенні, понад 30 с – 28,6% при профілактичному та 14,3% при лікувальному режимі). Це свідчить про тенденцію до відновлення м`язового тонусу та координації рухів після холодової травми під дією АРІЛ-1, особливо при профілактичному введенні, коли відсутні достовірні відмінності з інтактними тваринами.

Таблиця 4

Вплив АРІЛ-1 на м’язовий тонус і координацію рухів у мишей у ранньому

відновлювальному періоді після гострого загального охолодження

в тесті стрижня, що обертається, за критерієм падіння (абс. / %)

Час падіння зі стрижня	Інтактний контроль (n=15)	Контрольна патологія (n=11)	АРІЛ-1, 3 мг/кг
			профілактичний режим (n=7)	лікувальний режим (n=7)
До 30 с	7 (46,7%)	10 (90,9%)*	5 (71,4%)	6 (85,7%)*
Понад 30 с	8 (53,3%)	1 (9,1%)*	2 (28,6%)	1 (14,3%)*

Примітка: * – достовірні відмінності з групою інтактного контролю (р ≤ 0,05).

Отримані дані збігаються з результатами вивчення фізичної витривалості мишей в тесті плавання з навантаженням через 2,5 год після холодової травми. Як видно з табл. 5, після охолодження час плавання мишей достовірно знизився в 1,4 раза порівняно з показником інтактних тварин (до 1 хв на поверхні води втрималось 72,8% мишей з групи контрольної патології та 30% інтактних).

Таблиця 5

Вплив АРІЛ-1 на фізичну витривалість мишей в тесті примусового плавання

з навантаженням через 2,5 години після гострого загального охолодження

Час утримання на воді	Інтактний контроль (n=15)	Контрольна патологія (n=11)	АРІЛ-1, 3 мг/кг
			профілактичний режим (n=7)	лікувальний режим (n=7)
Кількість мишей, що втримались на поверхні води (абс. / %)
До 30 с	0	3 (27,3%)*	1 (14,3%)	0
0,5-1 хв.	3 (30%)	5 (45,5%)	2 (28,6%)	3 (42,9%)
1-2 хв.	7 (70%)	3 (27,3%)*	2 (28,6%)*	2 (28,6%)*
Понад 2 хв.	0	0	2 (28,6%)*^#	2 (28,6%)*^#
Тривалість плавання, M±m
Абсолютний час, с	62,7±4,4	44,1±4,8*	118,4±34,2^#	90,7±25,8

Примітка: * – достовірні відмінності з групою інтактного контролю (р ≤ 0,05); ^# – з групою контрольної патології (р ≤ 0,05).

АРІЛ-1 за обох режимів введення сприяв достовірному збільшенню фізичної витривалості в 2,1-2,7 раза. Результати свідчать не тільки про повне відновлення м`язового тонусу та фізичної витривалості мишей після загального охолодження, але й про достовірне збільшення (в 1,9 раза) часу плавання порівняно з інтактними при профілактичному введенні АРІЛ-1 та тенденцію до збільшення (в 1,4 раза) витривалості – за лікувального режиму введення.

Результати свідчать, що при загальному гострому охолодженні рівень ІЛ-1 в сироватці крові експериментальних тварин зростає на відміну від локальної кріотравми, де вміст ІЛ-1 знижувався [8]. На моделі загального охолодження АРІЛ-1 зменшує рівень ІЛ-1, що сприяє підвищенню холодової витривалості тварин, а також забезпечує відновлення пригнічених показників локомоторної, дослідницької активності та емоційності тварин, тонусу скелетних м`язів, координації рухів та фізичної витривалості після холодової травми.

Таким чином, визначено, що на моделі гострого загального охолодження АРІЛ-1 в дозах 3 та 15 мг/кг достовірно збільшує час виживання мишей порівняно з відомим фрігопротектором ацетилсаліциловою кислотою. Одноразове лікувальне або профілактичне застосування АРІЛ-1 в дозі 3 мг/кг при холодовій травмі нормалізує пригнічені показники локомоторної, дослідницької активності та емоційності тварин, покращує тонус скелетних м`язів, координацію рухів та фізичну витривалість у відновлювальному періоді.

АРІЛ-1 виявляє виражену фрігопротекторну дію, що обгрунтовує можливість його застосування в якості ефективного засобу профілактики та лікування наслідків холодової травми. До механізмів фрігопротекторної дії можуть залучатися як протизапальні, так і нейропротекторні властивості АРІЛ-1. Значне місце у цих механізмах належить зниженню концентрації ІЛ-1, який є одним з медіаторів розвитку кріопошкоджень.

Література:

1. Бабийчук Г. А., Шифман М. И. Нейрохимические процессы в центральной нервной системе при гипотермии.— Киев: Наукова думка, 1989. — С. 150.

2. Гацура В.В. Методы первичного фармакологичного исследования биологически активных веществ. - М., Медицина, 1974. – С. 22-23.

3. Доклінічні дослідження лікарських засобів : метод. рек. / за ред. член-кор. АМН України О.В. Стефанова. – К.: Авіценна, 2001. – С. 352-360.

4. Дрозд С.Ю., Бондаренко С.В., Яснецов В.В., Батраков С.Г., Саканделидзе О.Г., Шашков В.С. Увеличение продолжительности жизни мишей при острых охлаждениях под воздействием препарата, выделенного из Laminaria Saccharina // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 1991. - №4. – С.383-384.

5. Киселева Т.Л., Фролова Л.Н., Алиева А.А., Мельникова Н.Н., Цветаева Е.В., Пинчук Е.О. Изучение анатомо-диагностических признаков сбора №1 для профілактики и лечения отморожений // Традиционная медицина. – 2009. - №2(17). - С. 42-47.

6. Коваленко Є.М. Фармакологічне вивчення протизапальної активності антагоніста рецепторів інтерлейкіна-1 (АРІЛ-1): автореф. … дис. канд. фарм. наук. – Харків, 2009 – 19 с.

7. Коптяева Р.Г. Цитокиновый профиль при превентивной терапии отморожений целекоксибом // Аллергология и иммунология. – 2008. - №1, Том 8. – С. 296.

8. Коптяева Р.Г., Сидоров П.И. Цитокиновый профиль при острой алкогольно-холодовой травме // Аллергология и иммунология. – 2007. - №1, Том 8. – С. 297.

9. Котельников В.П. Отморожения. - М.: Медицина, 1988. - 256 с.

10. Котельников В.П., Морозов В.Е. Нейрогуморальные механизмы адаптации к криотравме / Вест. Рос. АМН. - 1992. - №11-12. - С.51-57.

11. Липатов К.В., Фархат Ф.А., Бородин А.В. и др. Глубокие отморожения конечностей: комплексный подход к диагностике и лечению // Врач. - 2005. - №9. - С.39-41.

12. Назаренко Н.А. Эффективность нестероидных противовоспалительных средств для профилактики и лечения холодовой травмы (экспериментальное исследование). Автореф. дис. доктора мед. наук - Архангельск, 2001. – 38 с.

13. Сбор лекарственных растений «Фитоморозко», обладающий фригопротекторным действием / Н.А. Назаренко, Т.Л. Киселева, А.А. Алиева, М.Ю. Назаренко, А.А. Карпеев (РФ). – № 2336896; заявл. 30.11.06; опубл. 27.10.08.

14. Средство из растительного сырья для профилактики и лечения отморожений / Н.А. Назаренко, Т.Л. Киселева, А.А. Алиева, М.Ю. Назаренко (РФ). – № 23426684; заявл. 26.10.06; опубл. 20.06.08.

15. Супрун Е.В., Штриголь С.Ю., Іщенко О.М. Церебро- та кардіопротекторна дія антагоніста рецепторів інтерлейкіну-1 на моделі церебральної ішемії у щурів // Клінічна фармація. – 2009. - №1, том 13. – С. 59-63.

16. Термическая травма: [рекоменд. для практ. врачей] / Под ред. С.В. Слесаренко, Г.П. Козинец, Е.Н. Клигуленко и соавт. – Днепропетровск, 2002. – 60 с.

17. Щокіна К.Г., Штриголь С.Ю., Іщенко О.М. Експериментальне вивчення фрігопротекторної дії рекомбінантного антагоністу рецепторів інтерлейкіну-1 (АРІЛ-1) // Фар маком. – 2010. - №3. – С. 74-79.

18. Anguera I., Vailis V., Giant. Wales in hypothermia // Circulation. – 2000. –Vol. 101. – P. 1627.

19. Hanania N., Zimmerman J. Enviromental emergencies: accidental hypothermia // Crit. Care Clin. – 1999. – Vol. 15, №2. – P. 235-249.

20. Mallet M.L. Pathophysiology of accidental hypothermia // Q. J. Med. – 2002. – Vol. 95. – P. 775-785.