УДК 636. 082 : 575. 113

ПЕРСПЕКТИВИ І ПРОБЛЕМИДОСЛІДЖЕНЬ З ТРАНСГЕНЕЗУ В ТВАРИННИЦТВІ

В. Дзіцюк

Національний університет біоресурсів і природокористування України

У статті узагальнені літературні дані про сучасний стан досліджень трансгенезу в тваринництві, його позитивні сторони і небажані наслідки.

Ключові слова: ТРАНСГЕННІ ТВАРИНИ, РЕКОМБІНАНТНІ ГЕНИ, РЕТРОВІРУСНІ ВЕКТОРИ, ЕКСПРЕСІЯ

Стрімкий розвиток біотехнології і молекулярної генетики сільськогосподарських тварин відкриває нові можливості для розвитку тваринництва. Сучасні реалії вимагають нових підходів до ведення племінної роботи, не заперечуючи водночас і традиційні методи створення нових і консолідацію вже існуючих порід сільськогосподарських тварин [1].

Наприкінці минулого століття відбулося глибоке інтегрування біотехнології та молекулярної генетики в сучасну зоотехнію і практику селекційно-племінної роботи. Проведені тоді роботи показали принципову можливість такої перспективи. [2]. Нині трансгенез стає стратегічним напрямом досліджень і цей процес вже є невідворотним. Заборонити його не вдасться, як свого часу не змогли це зробити з атомною енергією. В цих реаліях, очевидно, слід звикати жити з новими генними формами і брати розумну участь у самому процесі їх створення і використання. Розвитку трансгенезу в значній мірі сприяли розробка і становлення методу трансплантації ембріонів сільськогосподарських тварин, яка нині включена до багатьох програм з розведення тварин у різних країнах світу, як така, що дає змогу найефективніше використати потенціал цінних генотипів і прискорити створення високопродуктивних стад. [3]..

Нині активно йде розроблення програм створення нових порід тварин за допомогою трансгенезу і цей процес відбудеться з значно меншими затратами часу та засобів.

Трансгенних тварин отримують внаслідок введення в геном тварини чужорідної генетичної інформації. Така інформація представляє собою або окрему ділянку ДНК з власними (гомологічними) регуляторними послідовностями або сконструйований з різних молекул ДНК гібридний (рекомбінантний) ген. Нині вже принципово вирішена проблема трансформації тварин з використанням клонованих генів[4.

Здійснюється міжвидове і внутрішньовидове перенесення генів, які кодують білки-гормони, ферменти та ін.

Трансгенні тварини є ідеальними експериментальними системами для дослідження молекулярно-генетичних основ онтогенезу, вивчення функцій чужорідного гену, оцінювання його біологічної дії на організм. Вони використовуються для дослідження патогенезу різних спадкових та інших захворювань, для виробництва біологічно активних білків.

Успіх генної інженерії почався з 1988 року, коли були вперше отримані трансгенні вівці, що продукують з молоком фактор зсідання крові, необхідний для хворих гемофілією[5]. У наступні роки було створено близько 20 типів трансгенних корів, кіз, свиней, овець, кроликів та інших тварин, які продукують цінні фармацевтичні речовини (інтерлейкіни, антитрипсин, інсуліноподібний фактор росту тощо).

Створення трансгенних тварин є трудомістким процесом. Не дивлячись на успіхи в області трансгенезу, ефективність отримання трансгенних сільськогосподарських тварин залишається дуже низькою. Так, за статистикою одну трансгенну тварину вдається одержати з 40 ін'єк¬тованих зигот миші, або з 100 зигот вівці або кози, або з 1500 зигот корови. З цих трансгенних тварин не більш 50 % експресують трансгенний білок. Однак навіть у трансгенної тварини, ідеальної за всіма параметрами, потомки далеко не завжди успадковують її якості. Ефективність трансгенезу, тобто кількість трансгенних тварин від загальної кількості пересадже¬них ембріонів, виражене у відсотках, залежно від їх виду коливається у незначних межах. У мишей цей показник у середньому складає 15%, у свиней-10-15%, у кроликів-10%, у овець, кіз, свиней і корів — 0,5 % і корів [6].

Нині для отримання трансгенних тварин використовується різні технології. У тваринництві найчастіше використовують метод мікроін'єкції, суть якого полягає у введенні розчину генних конструкцій у чоловічий пронуклеус зигот. Але спосіб є малоефективним, оскільки в процесі інтеграції відбуваються численні перегрупування копій вбудованих ділянок ДНК в довільному місці і у випадковий спосіб. Під час мікроін'єкції трансгени навмання інтегруються в будь-яку частину геному. Це означає, що вони можуть руйнувати гени або розташовуватись в недоступних для транскрипції частинах хромосоми.

Наряду з методом мікроін’єкцій застосування знайшли інші методи: введення ретровірусних векторів, запліднення in vitro яйцеклітин сперматозоїдами з екзогенною ДНК та використання ліпосом [7]... як векторів чужорідної ДНК [8]. Отримання трансгенних тварин великої рогатої худоби з використанням ретровірусних векторів [9] показали перспективу щодо ефективного транспорту генів таким шляхом у сільськогосподарських тварин. До того ж перевагою використання ретровірусних векторів є те, що до 100 % ембріонів тварин можуть бути трансгенними. Недоліком є їх обмежена ємність (вставка за розміром не повинна перевищувати 8 тисяч пар нуклеотидів). а також пригнічення експресії трансгенів іп vivo внаслідок інактивації вірусних промоторів у клітинах.

Як природні вектори, що доставляють ДНК у клітини, використовуються сперматозоїди [9, 10]. У 1987 р. була показана можливість перенесення ДНК SV40 у яйцеклітини кроликів після штучного запліднення спермою, попередньо інкубованою з ДНК [11], а в дослідах Lavitrano зі співавт. 30% мишей, отриманих після запліднення обробленою ДНК спермою, виявилися трансгенними і передавали трансген потомкам [12]. Однак дослідниками отримані суперечливі результати навіть у одній лабораторії і за однієї схеми досліджень[13]..

Значні матеріальні затрати і витрати часу стимулюють дослідників шукати нові підходи. Революційною в створенні трансгенних організмів стала технологія ЕСК (ембріональні стовбурові клітини) [14].. Трансформовані ембріональні стовбурові клітини трансплантують у порожнину бластоцисти. Таким чином кожен ембріон, який розвинувся в культурі після пересадки ядер, буде трансгенним і далі селекціонувати такі ембріони не потрібно. Окрім того, пересадка отриманих трансгенних ембріонів реципієнтам призведе до народження тільки трансгенного потомства. До того ж використання трансформованих ембріональних стовбурових клітин для одержання трансгенних тварин дає змогу у ряді випадків проводити оцінку експресії трансгенів, що має важливе значення.

Для отримання рекомбінантних білків (інтерферон, еритропоетин тощо) з молоком самок в молочну залозу дорослих особин вводять екзогенні гени. Причому цей спосіб трангенезу порівняно з мікроін’єкцією ДНК в пронуклеус зиготи значно скорочує затрати часу від початку експерименту до отримання перших результатів про рівень експресії. Мова йде про 4–5 місяців порівняно з 4–5 роками[15]..

Часто трапляється, що генна конструкція може взагалі не вбудуватися в геном тварини, а якщо і вбудується, то може виявитися не у всіх клітинах. З трансплантованих яйцеклітин з генної конструкцією прижитися може лише п'ята частина, а вбудуватися в потрібну ділянку геному — 1–2 %. Великого мистецтва вимагає і трансплантація зиготи в статеві шляхи самки. Інша проблема - пошук і виділення найбільш ефективних генних конструкції.

Вже отримані трансгенні за геном химозину кролики з промотором казеїну великої рогатої худоби. У деяких кроликів в 100 мл молока міститься до 150 мг хімозину, а за лактацію від одного кролика можна одержати таку кількість хімозину, яке здатне переробити до 10 т коров'ячого молока. Якщо врахувати, що для згортання 1 т молока при виробництві сиру потрібно 1 г хімозину, то для виробництва сиру в Україні буде потрібно лише 300 кг хімозину. Для цього необхідно мати «біотехнологічну» або «генну» ферму на 5 - 6 корів або 300 овець чи кіз. [16].. Використання корови або вівці є набагато продуктивнішим і дешевшим, а використання на одиницю біологічної продукції овець та кіз значно дешевше, ніж корів, оскільки вівці та кози мають коротший репродуктивний період і відкривається можливість швидкого розмноження трансгенних тварин та створення промислового стада продуцентів. . [17].. Однак говорити про створення в найближчому майбутньому розвиненої та діючої біоіндустрії на основі трансгенних овець і кіз передчасно.

Можливо, в майбутньому для трансгенних тварин будуть знайдені також інші області застосування, але вже зараз ясно одне: у XXI ст. використання трансгенних тварин буде досить розповсюдженою технологією.

Розробка теорії трансгенезу сільськогосподарських тварин і пошуки шляхів практичного використання цього методу йдуть паралельно, у зв'язку з чим одержання як позитивних так і негативних результатів цілком можливо. При переході порога внутрішніх можливостей корекції посиленого генно-інженерним шляхом ознаки метаболічними системами тварин наставало розвиток різних патологічних змін, у тому числі і прогресуючих, що призводять до скорочення тривалості життя трансгенних тварин, порушення їх відтворної функції [18, 19].

Наряду з розвитком трансгенезу у тваринництві постають питання суто етичного плану. Аргументом є те, що роботи з трансгенезу з тваринами є насильством над законами природи. Рівноцінним аргументом може існувати думка, що більшість із нині існуючих порід свійських тварин створена з використанням селекції, яка теж є одним із способів генетичної модифікації. [20]. З практичної точки зору є думка, що чужорідні гени, введені в геноми, можуть вплинути на безпечність для споживання відповідних продуктів. Небезпекою є виникнення у трансгенному організмі сприятливих умов для розвитку патогенів.

Висновки. Таким чином, процес створення трансгенних тварин стрімко розвивається і цей стрімкий розвиток дає змогу зробити лише деякі передбачення щодо його перспектив, небезпек і використання.

Перспективи подальших досліджень. Використання трансгенних тварин певною мірою відкриває нові можливості розвитку тваринництва. Перспективними є розробки щодо поліпшення якостей домашніх тварин введенням у них генів, що кодують стійкість тварин до різних захворювань, а також генів резистентності до спадкових хвороб, до хвороб кінцівок, маститу тощо та введення генів, спрямованих на оптимізацію отримання тваринницької продукції (якості молока, прискорення темпів росту). Активно буде розвиватись напрямок досліджень, в якому трансгенні тварини використовуються для виробництва біологічно активних речовин, отримання яких традиційними методами в достатніх кількостях і з бажаною якістю неможливе.

ЛІТЕРАТУРА

1. Брем Г., Кройслих X., Штранцингер Г. Экспериментальная генетика в животноводстве // М. РАСХН. 1995.326 с

2. Дыбан А.П. Трансгенные млекопитающие в биологии развития. // Онтогенез. Т.20. №6. 1989:577-592

3. Ю.Зиновьева Н.А., Эрнст Л..K, Брем Г. Трансгенные животные и возможности их использования: молекулярно-генетические аспекты трансгенеза в животноводстве// ВИЖ.-2001.-128 с.

4. ]... Chan A.W.S. Transgenic animals: current and alternative strategies // Cloning.-2010. - V. l.-N. l.-P. 25-46.

5. Jaenish R.Transgenic animals//Science.-1988.-V.240.-P. 1468-1474..

6. Brem G. Transgenic animals.//In Biotechnology. N.-Y.:VCH Press.-1993.-P.745- 832.

7. ]... Bachiller D., Schellander K., Peli J., Ruther U. Liposome-mediated DNA uptake by sperm cells // Mol. Reprod. Dev. 1991. - V. 30. - P. 194-200.

8. Прасолов B.C. Ретровирусные векторы—эффективная система переноса и экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих.// Молокулярная биология,-1989.-Т.23.-Вып.2.-С.8-12

9. Haskell R., Bowen R. Efficient production of transgenic cattle by retroviral infection of early embryos // Mol. Reprod. Dev.-1995.-№(3)-P.386-390.

10. Sperandio S., Lulli V., Bacci M.L., Fomi M., Maione В., Spadafora C., Lavitrano M. Sperm-mediated DNA transfer in bovine and swine species // Animal Biotechnology. 1996. - V. 7. - P. 59-77.

11. David H. McCulloh, Robert J. Wall, Herbert Levitan Fertilization of rabbit ova and the role of ovum investments in the block to polyspermy. // Developmental Biology. 1987.- V.120., 2. P. 385-391

12. Brinster, R. L., Snadgren, E. P,, Behringer, R. R. and Palmiter, R. D. No simple solution for making transgenic mice. // Cell. 1989.- 59:239-241

13. Gruenbaum Y., Revel E., Fainsod A. Sperm cells as vectors for generation of transgenic chickens // J. Cell Biochem.-1991.-Suppl.15.-P.194.

14. Lavitrano, M. et al. Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: Genetic transformation of mice. Cell 1989. v. 57 №7 P.723

15. Perry A.C., Wakayama Т., Kishikawa H., Kasai Т., Okabe M., Toyoda Y., Yanagimachi R. Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection //Science. 1999.-V. 284.-P. 1180-1183

16. Gannon F., Powel R., Barry T. et al. Transgenic farm animals// J. Biotech.-1990.-V.16-P. 155-170.

17. Tran N., Porada C., Zhao Y. et al. In utero transfer and expression of exogenous genes in sheep.// Exp. Hematol. -2000.-V.28.-P. 17-30.

18. Robertson et al., 1986 Robertson, E. Pluripotential stem cell lines as a route into the mouse germ line. Trends Genet. 1986, v.2: P. 9-13

19. Зиновьева Н.А., Эрнст Л.K, Брем Г. Трансгенные животные и возможности их использования: молекулярно-генетические аспекты трансгенеза в животноводстве// ВИЖ.-2001.-128 с.

20. Эрнст JI.K. Животноводство—XXI век//Инф. бюл. Новое в животноводстве.-1998.-№ 1 (01 ).С .6-7.).