Клиса С. Д., Нефёдов Л.И., Глазев А.А.

ГрГУ имени Я. Купалы НИЛ «Биохимии биологически активных веществ»

Влияние алкалоидов Chelidonium majus L.(препарата UKRAIN) на аминокислотный пул эритроцитов крови при злокачественном росте

В связи с ростом онкопатологии актуальным является поиск не только эффективных, но и менее затратных, экономически оправданных способов диагностики и лечения злокачественных заболеваний, в первую очередь - на ранних стадиях их развития.

В последнее десятилетие оправданно возрос интерес к аминокислотам и их дериватам как к средствам, применяемым для лечения широкого спектра заболеваний, в том числе - онкологических. Это обосновано тем, что соединения этого класса играют важную роль в патогенезе новообразований на уровне регуляции основных звеньев (клеточная пролиферация и дифференцировка, процессы апоптоза), включая формирование неспецифических адаптивных реакций[1-3].

Наш особый интерес к изучению закономерностей формирования фонда свободных аминокислот и их производных, а также метаболических процессов, определяющих онкогенез, обусловлен тем, что аминокислоты являются наиболее важными соединениями, участвующими в метаболизме азота и синтезе большинства эндогенных биологически активных соединений (биорегуляторов)[2,3].

В самое последнее время в экспериментальных и клинических исследованиях продемонстрировано, что формирование фонда и уровни отдельных аминокислот в жидкостях и тканях опухоленосителя и опухолевой ткани регулируются тиофосфамидными производными алкалоидов многолетнего травянистого растения из семейства маковых (Papaveraceae) Chelidonium majus L - растением, лечебные свойства которого доказаны и широко используются на практике, включая специфическое лечение опухолевой болезни[1,4].

Одновременно, убедительно доказано, что отдельные производные алкалоидов обладают способностью специфически связываться с раковыми, но не здоровыми клетками и при внесении их суммы в среду инкубации in vivo значимо изменяют эффективные концентрации аминокислот с выраженной тенденцией к нормализации аминокислотного дисбаланса[5].

В связи с вышесказанным целью настоящей работы является определить эндогенные концентрации свободных аминокислот в плазме крови больных злокачественными новообразованиями желудочно-кишечного тракта и мочеполовой системы и значимость изменений в процессах формирования фонда исследуемых соединений для диагностики онкозаболеваний in vivo и in vitro.

Материалы и методы

Исследование закономерностей формирования фонда свободных α-аминокислот их производных в норме, при онкопатологии, а также при онкопатологии на фоне добавления in vitro алкалоидов Chelidonium majus L. проводилось на образцах плазмы крови здоровых доноров и онкологических больных с диагнозом колоректальный рак.

Цельную кровь (5,0 мл) из локтевой вены утром натощак забирали в гепаринизированные пробирки при поступлении больных в стационар или в день взятия донорской крови. Цельную кровь объемом 1 мл переносили в микроцентрифужные пластиковые пробирки типа Eppendorf, дополнительно внося в часть из них 100 мкл препарата NSC-631570 (в концентрации 20мг/мл). Полученные образцы цельной крови инкубировали в термостате при температуре 37ºС в течение 150 минут.

Подготовка проб для анализа свободных аминокислот включала осаждение глобулиновой фракции белков крови раствором сильной кислоты (наилучшие результаты дало применение хлорной кислоты НСlО4 [6]).

Фракции плазмы и эритроцитов крови получали центрифугированием проинкубированных образцов цельной крови в течение 15 мин при 1500 об/мин на центрифуге Biofuge Primo R (Германия), с последующим отбором фракции плазмы и эритроцитов крови и обязательным отбрасыванием лейкоцитарного слоя.

Депротеинизацию образцов осуществляли в пластиковых пробирках “Eppendorf”, что исключало контакт исследуемых образцов со стеклянной посудой и металлическими предметами. Последнее уменьшает загрязнение проб ионами тяжелых металлов, что повышает воспроизводимость определения аминокислот методом ВЭЖХ, так как ионы металлов оказывают влияние на процесс дериватизации аминокислот с о-фталевым альдегидом

Фракцию форменных элементов (эритроцитов) подвергали гемолизу добавлением 2-х кратного объема дистиллированной воды, с последующей инкубацией в термостате при 37ºС в течение 30 мин, и депротеинизировали, смешивая ее с равным исходному образцу эритроцитов (в данном случае 250 мкл) объёмом 1M НСlО4, содержащей внутренний стандарт гомотаурин в концентрации 300 мкМ, центрифугировали в течение 20 мин при 12000g для получения хлорнокислого экстракта содержимого форменных элементов.

Аминокислоты и их производные определяли высокочувствительным и высокоселективным методом обращённо-фазной жидкостной хроматографии, разработанным в НИЛ «Биохимии биологически активных веществ», позволяющий определять широкий спектр α-аминокислот и их метаболитов в плазме и форменных элементах крови человека и животных[7].

Результаты исследований обрабатывались с помощью программного пакета «Statistica 8.0». Кроме общепринятого сравнения исследуемых показателей с применением критерия Стьюдента, использовались методы многомерного статистического анализа и моделирования[8].

Результаты

При колоректальном раке на фоне общего обогащения эритроцитов крови аминокислотами и их производными происходит однонаправленное снижение концентрации Gln(в 1,7 раз). Особое внимание следует обратить на шестикратное увеличение концентрации Arg. Также отмечается увеличение содержания Ala(в 1,7 раз), Thr(на 60%), CA(в 2 раза) и Tau(на 40%).

Инкубация крови онкологических больных in vitro с производными алкалоидов чистотела индуцировала существенные изменения в фонде аминокислот и их метаболитов в эритроцитах: тенденцию к нормализации уровней аминокислот и их производных по сравнению со значениями без добавления препарата. Концентрация Arg увеличена лишь в 2 раза. Исключения составляют: двоекратное увеличение уровня Gln, увеличение на 30% уровня Gly и уменьшение на 33% содержания His.

Рисунок 1 – Проекция на плоскость двух главных компонент при исследовании действий алкалоидов Chelidoniun majus L. на пул соединений эритроцитов крови здоровых доноров и больных колоректальным раком.

Из графика двух главных компонент (рисунок 1), полученного при проведении канонического анализа при исследовании действий алкалоидов Chelidoniun majus L. на пул соединений эритроцитов крови здоровых доноров и больных колоректальным раком видно, что образцы плазмы крови образуют 4 группы ("колоректальный рак", "колоректальный рак+UKRAIN, "здоровый контроль", "здоровый контроль+UKRAIN"), различающиеся по характеру изменений в содержании аминокислот при действии алкалоидов Chelidoniun majus L. Данное утверждение подтверждается значениями величин D2-Махаланибиса.

Выводы

Новообразования индуцируют обеднение фонда свободных аминокислот эритроцитов и специфические изменения в концентрациях отдельных аминокислот, которые могут служить дополнительным дифференциально-диагностическим критерием локализации опухолевого процесса.

Инкубация in vitro крови с производными алкалоидов чистотела большого приводит к специфическим изменениям в содержании отдельных аминокислот эритроцитов раковых больных. Выявленные изменения отличаются от таковых у доноров и могут служить дополнительным критерием наличия и локализации опухолевого процесса.

Значимость полученных изменений в специфических характеристиках формирования аминокислотного пула больных с исследованным локализациями неоплазм для диагностик раковой болезни подтверждается результатами проведенного линейно-дискриминантного анализа и полученными значениями D2-Махаланобиса.

Выявленные изменения, наряду с полученными in vivo, могут служить дополнительным дифференциально-диагностическим критерием наличия и локализации опухолевого процесса.

Список использованной литературы

1. Потопальский, А.И. Препараты чистотела в биологии и медицине / А.И. Потопальский. – Киев: Наукова думка, 1992. – 239 с.

2. Клиса С.Д. Свободные аминокислоты и их производные в качестве показателей метаболического дисбаланса при злокачественных новообразованиях.//Зоологические чтения 2012: Матер. Респ. науч.-практич. конференции(Гродно, 2-4 марта 2012 г.) / О.В. Янчуревич(отв. ред.)[и др.].- Гродно:ГрГМУ, 2012

3. Нефёдов, Л.И. Формирование фонда свободных аминокислот и их производных в условиях метаболического дисбаланса: автореф. … дис. докт. мед. наук: 03.00.04 / Л.И. Нефёдов; Белор. гос. ун-т. – Минск, 1993. – 34 с.

4. Угляница, К.Н. Ukrain® (биологическая активность и применение в медицине) / К.Н. Угляница, Л.И. Нефёдов, В. Бжоско. – Гродно: ГОУТ, 2000. – 290 с.

5. Глазев А.А. Механизмы действия алкалоидов чистотела и их производных на биологический объекты, модифицированные опухолевым процессом // Дис. на соискание к.б.н. / ГрГУ им. Я.Купалы. Гродно, 2009

6. Дорошенко, Е.М. Формирование фонда биогенных аминов и нейроактивных аминокислот в головном мозге крыс при алкогольной интоксикации и отмене этанола: дис. … канд. биол. наук: 03.00.04 / Е.М. Дорошенко. – Гродно, 1994. – 95 л.

7. Глазев, А.А. Обращённо-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография L-аминокислот и их производных / А.А. Глазев, Л.И. Нефедов // Европейская наука XXI века – 2007: материалы II междунар. науч.–практ. конф., Днепропетровск, 16–31 мая 2007 г. / Днепропетровск: Наука и образование, 2007. – Т. 9. – С. 64–65.

8. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Изд. 3-е, испр. Минск. «Вышэйш. школа», 1973. 320 стр. с илл.