Биологические науки/9 Биохимия и биофизика
д.т.н. Тырсин
Ю.А.1, к.т.н.
Шеламова С.А.2
Московский
государственный университет пищевых производств, Россия
Воронежский
государственный университет инженерных технологий, Россия
Кинетика ферментативного гидролиза триацилглицеролов
В настоящее время в биотехнологии активно
проводятся исследования биокатализа в средах, содержащих органические
растворители. Это не удивляет, так как он имеет потенциальные преимущества, а
именно 1) относительно высокая растворимость многих соединений в органических
растворителях; 2) возможность полностью обращать гидролитические реакции в реакции
синтеза.
Согласно данным литературы активность
биокатализаторов зависит от полярности растворителя [1]. В качестве меры
полярности растворителей используется log
коэффициента распределения в стандартной двухфазной жидкой системе октанол-вода
– log P. сильно гидрофильные растворители с log P < 2 инактивируют
или денатурируют ферменты; менее водорастворимые с log P от 2 до 4
слабо деформируют водное окружение биокатализатора, и влияние их на активность
довольно непредсказуемо; растворители с log P > 4 в силу
большой полярности не способны взаимодействовать с водной оболочкой и оставляют
фермент в активном состоянии. Исключение составила панкреатическая липаза – они
сохраняла активность в практически всех испытуемых растворителях; не выявлено
строгой корреляционной зависимости между активностью и log P [2]. Экспериментальные
исследования ферментативного катализа в растворителях показывают, что влияние
их зависит от особенностей фермента, полярности субстратов, вида носителя для
иммобилизации ферментов.
Нами исследован гидролиз триацилглицеролов
под действием иммобилизованного препарата липазы Rh. oryzae 1403 в водной среде и в системах с органическими
растворителями.
Триацилглицеролы с высокой температурой
плавления и находящиеся в твердом состоянии при оптимальной температуре
действия липазы Rh.
oryzae 1403 (35 ºС), не подвергались
превращениям. Поэтому их гидролиз был проведен в системе с растворителями с
различной полярностью – гексаном (log P 3,5) и бутаноном (log P 0,28).
Полученные данные представлены в таблице.
Таблица
Кинетические
характеристики гидролиза триглицеридов
иммобилизованной
липазой Rh. oryzae 1403
Субстрат |
Vmax , mМ×мин-1×г-1 |
KM, mМ |
Vmax /KM, г-1×мин-1× |
|||
Без растворителя |
||||||
Трибутирин |
505±30 |
810±52 |
0,62±0,04 |
|||
Трикапроин |
620±37 |
765±46 |
0,81±0,05 |
|||
Трикаприлин |
780±48 |
620±40 |
1,26±0,08 |
|||
Трикаприн |
910±54 |
510±28 |
1,78±0,1 |
|||
Триолеин |
1810±91 |
390±25 |
4,64±0,3 |
|||
Трилинолеин |
2030±110 |
350±20 |
5,80±0,4 |
|||
Растворитель –
гексан |
||||||
Трилаурин |
1150±61 |
720±43 |
1,60±0,09 |
|||
Тримиристин |
1390±82 |
980±59 |
1,42±0,08 |
|||
Трипальмитин |
1520±91 |
1190±72 |
1,28±0,07 |
|||
Тристеарин |
1740±104 |
1450±87 |
1,20±0,07 |
|||
Растворитель –
бутанон |
||||||
Трилаурин |
450±32 |
920±52 |
0,49±0,02 |
|||
Тримиристин |
720±45 |
840±48 |
0,86±0,04 |
|||
Трипальмитин |
890±54 |
680±10 |
1,31±0,07 |
|||
Тристеарин |
1020±67 |
610±35 |
1,67±0,08 |
|||
С увеличением длины цепи жирной кислоты в
составе ТАГ скорость гидролиза возрастала вне зависимости от системы реакции.
Это согласуется с результатами исследований липаз, в которых показано, что
переходные состояния ацилирования-деацилирования не изменяются при переходе от
растворителя к растворителю [3]. Характер изменения KM определялся полярностью среды реакции: в
воде и бутаноне значения KM уменьшались с длиной цепи, а в гексане – увеличивались. Таким образом,
в неполярном растворителе требуется преодолеть более высокий энергетический
барьер для связывания субстрата с ферментом. Судя по константам скорости
второго порядка – Vmax /KM , специфичность к кислотам с большой длиной
цепи проявлялась в воде и полярном растворителе; в неполярном растворителе
наблюдалось обращение специфичности к длине цепи жирной кислоты. Эффективность
гидролиза в бутаноне была ниже в 2,8–3,6 раз по сравнению с водной средой, что
объясняется значительным снижением скорости реакции.
Уменьшение эффективности гидролиза
триглицеридов в гексане главным образом связано с возрастанием константы
Михаэлиса в 1,4–3,7 раз. Эти результаты согласуются со свойством разделения
гидрофобных субстратов между средой реакции и активным центром липазы. Это
разделение уменьшается до минимума при увеличении гидрофобности и субстрата, и
растворителя, требуя таким образом большей концентрации субстрата для насыщения
фермента и следовательно, получаются более высокие значения KM. Каталитическая эффективность
уменьшается и приводит к затруднению взаимодействия фермента и субстрата.
Литература:
1. Rules for Optimization of Biocatalysis in Organic
Solvents [Text] / C. Laane, S. Boeren, K. Vos, C. Veeger // Biotechl. Bioeng. –
1987. –V. 30. – P. 81–87
2. Zaks, A. The effect of water on enzyme action in organic media [Text] /
A. Zaks, A. Klibanov // J. Biol. Chem. – 1988. – V. 263, № 17. – Р. 8017–8021
3. Wescott, C. R.
The solvent dependence of enzyme specificity [Text] / C. R. Wescott, A. M.
Klibanov // Biochim. Biophys. Acta. – 1994. – V. 1206. – P. 1-9
Zaks & Klibanov изучили
реакцию трансэтерификации между трибутирином и гептанолом с участием различных
липаз в почти безводных растворителях. Зависимости активности от log P для
липаз дрожжей и грибов имели S-форму (рис.
1). Подобные сведения сообщены для 20-β-гидроксистероид-дегидрогеназы и
для ксантиноксидазы.
По мнению Zaks & Klibanov,
возможны различия в конформации этих трех ферментов: внешняя часть
панкреатической липазы может быть более гидрофобной и необходимая вода
связывается с молекулой сильнее.
[454]
Однако в продолжение такого толкования
получается, что растворители, насыщенные водой, должны быть безвредными для
биокатализаторов. Но практически всегда растворитель бывает насыщен водой, либо
до проведения реакции, либо в реакционной среде. Поэтому более верное
объяснение подавления активности ферментов в присутствии отдельных
растворителей видят в деформации хрупкого водного слоя, стабилизирующего
биокатализатор или в вытеснении этого слоя. Для дополнительного доказательства
деформирующего действия растворителей было проведено сравнение их растворимости
в воде с log P. Результаты, полученные для примерно 30 растворителей
(табл. 1), позволили разделить их на три группы.
Таблица 1
Максимальная растворимость
органических растворителей
в воде и значения log P
Коэффициент полярности |
Растворимость в воде (20 ºС), масс. % |
log P ≤ 2 |
> 0,4 |
2 < log
P< 4 |
0,04–0,4 |
log P ≥ 4 |
< 0,04 |