Химия /6. Органическая химия

Харченко В.О., Трембач Е.А., Трембач А.А., Россихин В.В.

Национальный технический университет «Харьковский политехнический институт», Харьков

АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ И МЕТОДЫ ЕЁ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящее время установлено, что возникновение и развитие широкого круга воспалительных заболеваний сопровождается активацией свободнорадикальных реакций (СРР) перекисного окисления липидов (ПОЛ), денатурации белков и нуклеиновых кислот. Эти реакции называются так, потому что они инициируются и развиваются с участием т.н. свободных радикалов. Свободные радикалы – это молекулы или частицы, обладающие не спаренными электронами.

Вклад всех компонентов эндогенной системы человека по защите липидов клеточных мембран и липопротеинов от перекисной деградации может быть определен путем измерения активности отдельных составляющих. Однако это оказалось практически невозможным из-за, во-первых, трудоемкости анализов и во-вторых, синергизма действия различных ингибиторов в системе защиты. Поэтому вот уже на протяжении 25-30 последних лет предпринимаются попытки создания методик для определения суммарной активности ингибиторов СРР, присутствующих в биологических жидкостях:сыворотке крови, моче, слюне, слезе, а также в гомогенатах тканей и суспензиях мембран и липопротеинов . В принципе любая методика определения антиокислительной активности (АОА) какого-либо индивидуального ингибитора СРР, смеси их или биологических жидкостей основывается на использовании некой модельной системы, которая включает в себя по крайней мере 2 компонента: механизм генерации определенного сорта СР и систему их детектирования. Введение в такую модельную систему перехватчика СР или веществ, влияющих на концентрацию или состояние ионов-катализаторов, приведет к уменьшению концентрации СР или катализаторов, что отразится на параметрах детектирующей системы.

Одной из первых доступных и воспроизводимых модельных систем окисления, примененной для определения АОА сыворотки крови был предложенный Стоксом и др. в 1974 г. гомогенат мозга [Stocks,1974]. С помощью этой модельной системы было показано, что: а) сыворотка крови и другие биологические жидкости ингибируют ПОЛ модельной системы, определяемое по увеличению концентрации вторичных продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-реактивные продукты); б) в сыворотке крови основной вклад в общую АОА вносят сывороточные белки: церулоплазмин и трансферрин; в) альфа-токоферол в физиологических концентрациях перекрывал лишь незначительную часть общей АОА сыворотки; г) альбумин, будучи добавленным к гомогенату в физиологических концентрациях, эффективно ингибировал накопление ТБК-реактивных продуктов, что могло быть обусловлено про мнению авторов, его способностью связывать различные лиганды и в том числе Fe²⁺ .

В качестве модельной системы окисления для определения общей АОА сыворотки крови возможно использование суспензии липопротеинов желтка яиц (ЖЛП), инициирование ПОЛ в которой осуществляли с помощью ионов двухвалентного железа. Суспензия ЖЛП, как модельная система отличается от других липидсодержащих систем доступностью получения, высокой стабильностью и относительно хорошей окисляемостью [Клебанов,1988]. Уровень процесса ПОЛ определяли по: а)накоплению ТБК-реактивных продуктов и выражали в количестве мкмолей малонового диальдегида (МДА) на 1 мл реакционной смеси; б) интенсивности Fe²⁺ -индуцированной хемилюминесценции.

При введении сыворотки крови в суспензию ЖЛП, было обнаружено уменьшение интенсивности ХЛ на стадии медленной вспышки. Поскольку такое влияние сыворотки крови на интенсивность ХЛ суспензии ЖЛП сопровождалось, как было показано нами ранее, параллельным снижением накопления ТБК-реактивных продуктов в реакционной среде, то оно может быть вызвано действием находящихся в сыворотке различных ингибиторов ПОЛ. Есть основания предположить, что наблюдаемое торможение ПОЛ модельной системы сывороткой крови обеспечивается главным образом сывороточными белками или связанными с ними веществами. Действительно, инактивация сывороточных ингибиторов ПОЛ путем нагревания сыворотки при 900 С 15 мин приводило к отмене ее ингибирующего влияния на ПОЛ суспензии ЖЛП. Более того, введение в модельную систему предварительно нагретой сыворотки крови привело к соокислению липидов ЖЛП и липопротеинов сыворотки, что проявилось в увеличении интенсивности ХЛ. Аналогичная ситуация наблюдалась и при введении в модельную систему липосом, которые проявляли себя в роли дополнительного субстрата окисления . Необходимо отметить, что тепловая обработка сыворотки крови практически не сказывалась на окисленности сывороточных липидов, определяемую по количеству ТБК-реактивных продуктов и содержанию альфа-токоферола (данные не приведены), в то время как активность одного из основных плазменных ингибиторов ПОЛ, церулоплазмина , снизилась с 4,40+-0.52 отн. ед-ц./мл до 1,30+-0,26 отн. ед-ц/мл (Р< 0,001) т.е. более чем в 3 раза по сравнению с контролем.

Введение сыворотки крови в суспензию ЖЛП приводило к уменьшению интенсивности ХЛ суспензии ЖЛП по мере увеличения объема добавляемой сыворотки. Это обстоятельство позволило для определения общей АОА сыворотки крови, как величины, не зависящей от ее объема, введенного в модельную систему, использовать прием, разработанный для случая модели жидкофазного окисления [Петрусевич,1972] и основанный на том, что скорость изменения концентрации пероксильных радикалов без и в присутствии ингибиторов в условиях стационарности реакций окисления описывается следующими уравнениями:

d[RO₂•] ₀ / dt = Wi - k₆ [RO₂•]² ₀= 0; d[RO₂• ] /dt = W - k₆ [RO₂•]² - k₇[InH][RO₂•] = 0. Где: Wi - скорость инициирования свободных радикалов; [RO₂•] ₀, [RO₂•] - концентрация пероксильных радикалов без и в присутствии антирадикального ингибитора соответственно; k₆ - константа скорости реакции рекомбинации пероксильных радикалов; K₇ - константа скорости реакции обрыва цепей окисления в результате взаимодействия антиоксиданта и пероксильного радикала; [InH] - концентрация антиоксиданта.

Решение этих уравнений дает связь между интенсивностью ХЛ системы без ингибиторов (I0) и после их введения (I)
бетта-коэфициент антиокислительной активности ингибитора.
В нашем случае бетта - параметр, характеризующий суммарную АОА сыворотки крови, а поскольку состав и молярные концентрации сывороточных антиоксидантов в модельной системе не известны, то вместо [InH] в формулу подставляется объем (V) добавленной сыворотки. Практически коэфициент бетта вычисляли как тангенс угла наклона линейного участка кривой, построенной в координатах :

Используя описанный выше прием, была исследована АОА сыворотки крови больных с неосложненным острым пиелонефритом (ОП), которым проводилась традиционная лекарственная терапия. Было обнаружено, что в острый период ОП у всех обследованных пациентов наблюдалось увеличение уровня общей АОА сыворотки крови с последующим снижением до нормального значения к 7-14 дню заболевания. Что же касается активности церулоплазмина в сыворотке крови этих больных, то в отличие от АОА, она повышалась постепенно, достигая своего максимального значения только к 5-7 дню течения ОП, когда уровень АОА сыворотки крови уменьшался уже почти в 2 раза по сравнению с его первоначальным максимальным значением. Важно подчеркнуть, что аналогичным образом в динамике ОП изменяется содержание и другого ингибитора ПОЛ - мочевой кислоты. Все это свидетельствует в пользу того, что увеличение общей АОА сыворотки крови в острый период ОП, на 1-2 сутки заболевания происходит, по-видимому, не за счет церулоплазмина, а с участием каких-то других сывороточных ингибиторов ПОЛ.

 Вместе с тем следует признать, что модельная система окисления на основе ЖЛП, несмотря на свою простоту и доступность не позволяет в полной мере использовать возможности хемилюминесцентного метода в интерпретации механизма действия различных антиоксидантов и АОА биологических жидкостей.