Медицина/ 8.Морфология

К.м.н., доц. Коцюба А.Е.

Владивостоксктй государственный медицинский университет, Россия

Цистатионин γ–лиаза артерий мягкой оболочки головного мозга человека

 

Известно, что сероводород (H2S) принимает участвует в регуляции артериального давления и сосудистого тонуса [4, 8].  За его синтез в сосудистой системе отвечает цистатионин γ-лиаза (CSE), которая экспрессируется в мышечных клетках [3, 4]. Однако большинство работ по изучению распределения ферментов синтеза H2S в стенке сосудов было выполнено на артериях с хорошо выраженной мышечной оболочкой (аорта, легочная, брыжеечная артерии) [7, 9]. В мелких артериях и артериолах с одним, зачастую, непостоянным слоем миоцитов, решающее значение в регуляции тонуса принадлежит эндотелий зависимым механизмам [2]. В связи с этим можно ожидать, что H2S в эндотелии этих сосудов играет более значительную роль, чем в артериях с развитой мышечной оболочкой.

Целью работы явилось изучение распределения CSE в стенке сосудов мягкой оболочки головного мозга разного типа.

Исследование выполнено на трупном материале от 4 мужчин 18-25 лет, без признаков каких либо заболеваний, погибших от механической травмы не связанной с повреждением головного мозга. Объектом исследования служили  сосуды I-V-го порядков бассейна средней мозговой артерии диаметром соответственно: 447-305 мкм, 284-213 мкм, 184-102 мкм, 86-67 мкм и 37-24 мкм. Для иммунногистохимического выявления CSE кусочки мозга с прилегающей мягкой оболочкой, фиксировали в течение 1 ч в 4%-ном растворе параформальдегида, приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) при 4°С. Из образцов готовили криостатные срезы толщиной 30 мкм, которые последовательно инкубировали с 1%-ной нормальной сывороткой лошади 1 ч при комнатной температуре мышиными моноклональными антителами против цистатионин γ–лиазы (в разведении 1 : 500) (Abcam, Bеликобритания) при температуре 4°С в течение 18 ч, биотинилированными антителами в разведении 1 : 100 (VectorLabs, США) 2 ч, а также с авидин-пероксидазным комплексом (Vectastain Elite ABC Kit, VectorLabs, США) 1 ч при комнатной температуре. Для выявления продуктов реакции под контролем микроскопа срезы инкубировали в субстрате для обнаружения пероксидазы (VIP Substrate Kit, VectorLabs, США). Затем срезы промывали, обезвоживали по стандартной методике и заключали в полистерол. Для контроля специфичности реакции проводили окрашивание срезов без первичных или вторичных антител. 

Вычисляли численную плотность энзимпозитивных  артерий в каждой размерной группе (за 100% принимали общее число встретившихся сосудов соответствующего диаметра), среди которых определяли долю сосудов с наличием фермента в эндотелии и/или в мышечных клетках. Значения активности фермента (в усл. ед.) вычисляли с использованием автоматизированной системы анализа изображений Allegro MC [1]. Для оценки значимости цифровых данных применяли t-критерий Стьюдента. Достоверными считали значения доверительного интервала, p < 0,05.

В результате проведенного нами исследования установлено, что наличие и распределение CSE в структурных элементах стенки артерий во многом зависит от диаметра сосудов (рис.1). В артериях  I-го и II-го порядков мелкогранулярный осадок откладывается только в мышечных клетках средней оболочки, маркируя их в зависимости от плотности отложения преципитата, в различные оттенки бордового цвета. При этом, интенсивность отложения продукта реакции в гладких миоцитах I-го и II-го порядков выявляется в меньшей степени, чем в  пиальных артериях III-го порядка (рис.2), где мышечные клетки обнаруживают более высокую концентрацию продукта реакции. Между тем, в артериях одного и того же порядка ветвления содержание CSE может существенно отличаться. В средней оболочке одних сосудов преципитат откладывается исключительно плотно, окрашивая сократительные клетки в насыщенные тона бордового цвета, в то время как в других сосудах, зачастую расположенных от них в непосредственной близости, интенсивность реакции в миоцитах невысокая, при которой клетки имеют бледно-розовый цвет. Отмечено, что выраженность реакции, чаще наблюдается в миоцитах, прилежащих к внутренней оболочке сосуда. В мышечных клетках пиальных ветвей IV-V-го порядка активность CSE чаще всего не определяется, а если и определяется, то очень низкая. Экспрессия фермента в этих артериях постоянно наблюдается только в эндотелии (рис.1). При этом мелкозернистый осадок, разной степени плотности, откладывается по всему или большей части периметра внутренней выстилки сосудов. В эндотелии более крупных артерий активность CSE более или менее стабильно определяется в ветвях III-го, и реже II-го порядка.

Таким образом, местом образования H2S в стенке пиальных артерий могут быть гладкие миоциты средней оболочки и эндотелий, в которых определяется экспрессия  CSE – фермента, участвующего в синтезе этого газа. Наличие и распределение цистатионин γ-лиазы в структурных элементах стенки артерий тесно связано с калибром и локализацией сосудов. Наличие CSE в эндотелии обычно наблюдается в мелких пиальных артериолах, в мышечных клетках CSE чаще выявляется в пиальных ветвях I-III-го порядков. Хотя имеется достаточно большое количество сосудов, в которых экспрессии CSE не отмечено. Высказывается предположение, что роль H2S в эндотелии и мышечных клетках сосудов существенно отличается [6, 8]. В эндотелии он может выступать как первичным фактором, инициирующим активность миоцитов через  миоэндотелиальные контакты [5], так и посредником в высвобождении других вазорелаксантов, прежде всего, оксида азота [9], не оказывая непосредственного влияния на тонус гладких миоцитов. 

 

Работа проведена при финансовой поддержке Федерального агентства при науке и инновациям – Федеральная целевая программа «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России». Номер государственного контракта  14.740.11.0186.

 

 

Литература:

1.     Афанасьев А.А., Коцюба А.Е., Черток В.М. // Тихоокеанский медицинский журнал. 2002.  Т. 10. № 3. С. 65-68.

2.     Черток В.М., Коцюба А.Е.  // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2010. Т. 149. № 3. С. 340-344.

3.     Gadalla M.M., Snayder S.H. // J. Neurochem. 2010. V. 113. Р. 14–26.

4.     Leffler Ch.W., Parfenova H., Basuroy Sh. et al.  // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2011. V. 300. № 3. H. 440-447.

5.     Luksha L., Agewall S., Kublickiene K. // Atherosclerosis. 2009. V.  202. P. 330-334.

6.     Shibuya N., Mikami Y., Kimura  Y. // J. Biochem. 2009. V. 146, № 5. Р. 623-626.

7.     Webb G.D., Lim L.H., Oh V.M.S.  et al. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2008 V. 324, № 1. Р. 876-882  

8.     Zhao W., Wang R. // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol.  2002. V. 283. № 2. Н. 474-480.

9.      Zhong G., Chen F., Cheng Y. et al.   // J. Hypertens. 2003. V. 21. P. 1879-1885.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

            

Рис.1. Численная плотность артерий мягкой оболочки головного мозга I – V-го порядка ветвления, имеющих положительную реакцию на цистатионин γ-лиазу. За 100% принято общее количество пиальных артерий соответствующего диаметра.  Доля сосудов с  активностью фермента:      1   -  в эндотелии,     2   - в миоцитах,  3  - в эндотелии и миоцитах. Активность фермента (      ).

 

 

Рис.2. Иммуноцитохимическое выявление цистатионин γ-лиазы в эндотелии (двойные стрелки) и миоцитах (одинарные стрелки) артерии мягкой оболочки головного мозга III порядка. Об.10х, ок. 10х.