К.б.н. Н.Н. Деникина¹, И.А. Небесных¹, М.П. Белых²,

к.б.н. А.М. Мамонтов¹, к.б.н. Н.Л. Белькова^1,2, к.б.н. Е.В. Дзюба¹

¹ Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Лимнологический институт СО РАН, Иркутск

² Федеральное государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования «Иркутский государственный университет», Иркутск

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДЕТЕКЦИЯ DIPLOMONADIDA В ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЕ БАЙКАЛЬСКОГО ОМУЛЯ COREGONUS MIGRATORIUS (GEORGI, 1775)

Diplomonadida – жгутиковые простейшие, одни из примитивных эукариот, лишенные характерных митохондрий, пероксисом и аппарата Гольджи [1]. Несмотря на сравнительно высокий уровень изученности животных озера Байкал, данные о видовом составе паразитических простейших до сих пор являются не полными [2, 3, 4]. В настоящее время известно, что в рыбах Байкальского региона встречаются представители двух родов – Hexamita (Octomitus) и Spironucleus [2, 5, 6]. Многие аспекты биологии и экологии этих животных, включая специфичных хозяев, географические ареалы и патогенность различных видов плохо изучены. Ранее нами была разработана молекулярно-генетическая диагностическая система для выявления дипломонад в пищеварительном тракте рыб, успешная апробация которой позволила определить зараженность Spironucleus barkhanus рыб сем. Thymallidae Восточной Сибири [7].

Байкальский омуль Coregonus migratorius (Georgi, 1775) считается достаточно хорошо изученным видом; постоянное внимание к его биологии определяется его экологической (один из ключевых видов экосистемы) и экономической (основной промысловый вид оз. Байкал) значимостью. Количество популяций байкальского омуля определяется количеством систем рек, в которых он размножается [8, 9]. Анализ репродуктивной разобщенности, морфологической и биологической разнокачественности популяций байкальского омуля позволили объединить их в морфоэкологические группы (МЭГ): 1) пелагическая (многотычинковая), 2) прибрежно-пелагическая (среднетычинковая) и 3) придонно-глубоководная (малотычинковая) [10]. Ранее в кишечнике байкальского омуля были обнаружены представители Diplomonadida - Hexamita truttae (Syn.: Octomitus truttae) [3]. Целью данного исследования стала оценка зараженности представителями Diplomonadida разных морфоэкологических групп байкальского омуля.

Сборы материалов выполняли при проведении гидроакустической съемки по учету ресурсов байкальского омуля 25 мая – 15 июня 2011 г. по всей акватории оз. Байкал. Общему биологическому анализу согласно стандартной методике [11] подвергнуто 119 экз. рыб. Для определения принадлежности особи к конкретной МЭГ использовалась система морфологических признаков [12]. Для анализа взяты желчные пузыри свежеотловленных рыб. Суммарную ДНК выделяли с помощью лизиса в растворе гидрохлорида гуанидина с последующей фенол-хлороформной экстракцией и использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции с ранее опубликованными праймерами 500L: 5’- cgtgccagcagccgcggtaa и DpR: 5’- agccgcagactccacrtct [7] в режиме: 94°С – 20 сек; 62°С – 20 сек; 72°С – 30 сек, 35 циклов. Полученные ампликоны длиной около 470 п. н. анализировали электрофорезом в 2% агарозном геле. Нуклеотидные последовательности определяли прямым секвенированием на автоматическом секвенаторе ABI310A (ABI PRISM 310 Genetic Analyzer) в Новосибирском приборном центре коллективного пользования СО РАН. Анализ последовательностей проводили с использованием сервиса Standard Nucleotide BLAST [13]. Положительный результат на наличие представителей отряда Diplomonadida получен для 17 из 58 особей прибрежной МЭГ, 14 из 41 придонно-глубоководной и 16 из 20 пелагической, что составляет 29, 34 и 80%, соответственно.

Проведенный анализ полученных в результате секвенирования нуклеотидных последовательностей фрагментов гена малой субъединицы рРНК дипломонад выявил их принадлежность виду S. barkhanus.

Полученные результаты сравнительного анализа зараженности байкальского омуля показали, что наибольшая доля инфицированных особей (80%) отмечена у рыб пелагической МЭГ. Это, вероятно, обусловлено различиями в питании рыб разных МЭГ. Байкальский омуль – эврифаг, в годовом рационе разных популяций сходные организмы. При этом у омуля пелагической (многотычинковой) МЭГ преобладает зоопланктон (эпишура Epishura baicalensis), у прибрежно-пелагической (среднетычинковой) - донные амфиподы, а у придонно-глубоководной (малотычинковой) – макрогектопус Macrohectopus branickii и молодь бычковых рыб (Comephorus dybowski, C. baicalensis, Cottocomephorus grewingkii, C. inermis и Leocottus kesslerii) [10, 14].

У омуля пелагической МЭГ индекс длины жаберной дуги (в % от длины головы) с возрастом уменьшается до 53,5%, что при большом количестве жаберных тычинок обеспечивает формирование своеобразного «жаберного сита», позволяющего отфильтровывать мелкие пищевые объекты. У представителей придонно-глубоководной МЭГ индекс длины жаберной дуги на 6-7% больше. Таким образом, длинная жаберная дужка при наименьшем количестве коротких жаберных тычинок и соответствующем увеличении расстояния между ними обеспечивает больший ток воды через жаберный аппарат при схватывании крупных пищевых объектов [10].

Представители рода Spironucleus, паразитирующие в рыбах, имеют прямой жизненный цикл с двумя этапами: неподвижные цисты в воде и подвижные трофозоиты в рыбе. Цисты - устойчивые стадии жизненного цикла дипломонад, способные выжить вне организма хозяина [15-17]. Их размеры от 0,3 до 13 мкм в диаметре. Тщательные исследования жизненного цикла не проводились, но предполагается, что цисты выходят из рыбы с фекалиями, проводят некоторое время в воде, а затем с водой и пищей попадают в нового хозяина [17]. Трофозоиты паразитических видов являются подвижными стадиями, активно питаются и размножаются в просвете кишечника рыб. Они не могут долго существовать вне хозяина (от 15-30 мин. у S. salmonis до четырех часов у S. salmonicida [18]). Однако в работах по экспериментальному заражению рыб было показано, что трофозоиты S. barkhanus способны выживать в пресной воде и, таким образом, не исключается возможность прямого инфицирования ими рыб [19]. Средняя длина тела трофозоитов составляет 15,6 мкм (11,0-20,0), а средняя ширина 9,4 мкм (6,0-14,0) [20]. Длина жгутиков может превышать размеры тела в 1,5-2,0 раза, таким образом, общая длина свободно двигающегося трофозоита со жгутиками достигает более 60 мкм [17]. Вероятно, байкальский омуль пелагической МЭГ способен отфильтровывать их на жаберном сите и заглатывать вместе с основным кормовым объектом эпишурой, минимальная длина тела науплиальных стадий которой составляет от 100 мкм [21].

Таким образом, с использованием молекулярно-генетического анализа в байкальском омуле впервые детектирован S. barkhanus. Морфологические различия в строении жаберного аппарата у трех МЭГ байкальского омуля, вероятно, являются факторами, способствующими более сильной зараженности пелагического омуля, чем прибрежного и придонно-глубоководного. Применение использованной диагностической тест-системы на основе молекулярно-биологического подхода необходимо как для детекции Diplomonadida в рыбах оз. Байкал и других водоемов Сибири с целью уточнения их видоспецифичности и ареалов, так и для проведения паразитологического мониторинга искусственно воспроизводимых и естественных популяций байкальского омуля.

Работа выполнена в рамках Программы Президиума РАН «Биологическое разнообразие» проект № 30.13.

Литература:

1. Keeling P.J., Doolittle W.F. Widespread and ancient distribution of a noncanonical genetic code in Diplomonads // Mol. Biol. Evol. – 1997. – Vol. 14. – P. 895–901.

2. Заика В.Е. Паразитофауна рыб озера Байкал. – М.: Наука, 1965. – 107 с.

3. Пронин Н.М. Полимастиготы (Mastigophora: Polymastigota) // Аннотированный список фауны озера Байкал и его водосборного бассейна: в 2 т. – Новосибирск: Наука, 2001. – Т. I, кн. 1: Озеро Байкал / О.А. Тимошкин, Т.Я. Ситникова, О.Т. Русинек и др. – С. 129.

4. Русинек О.Т. Паразиты рыб озера Байкал (фауна, сообщества, зоогеография, история формирования). – М.: Товарищество научных изданий КМК, 2007. – 571 с.

5. Пугачев О.Н. Каталог паразитов пресноводных рыб Северной Азии. Простейшие. - СПб., ЗИН РАН, 2001.– 242 с.

6. Белькова Н.Л., Дзюба Е.В., Суханова Е.В. Молекулярно-генетическая идентификация кишечной микрофлоры и протистов байкальских рыб // Аннотированный список фауны озера Байкал и его водосборного бассейна: в 2 т. – Новосибирск: Наука, 2009. – Т. II, кн. 1: Водоемы и водотоки юга Восточной Сибири и Северной Монголии / О.А. Тимошкин, В.И. Провиз, Т.Я. Ситникова и др. – С. 957–980.

7. Деникина Н.Н., Небесных И.А., Суханова Е.В., Белькова Н.Л. , Русинек О.Т., Дзюба Е.В. Разработка и апробация метода детекции представителей отряда Diplomonadida для исследования зараженности рыб // Биологические науки Казахстана. – 2011. – № 4. – С. 28–33.

8. Смирнов В.В., Шумилов И.П. Омули Байкала.– Новосибирск: Наука, 1974. – 160 с.

9. Smirnov V.V. Intraspecific structure of Baikal omul Coregonus autumnalis migratorius (Georgi) // Pol. Arch. Hydrobiol. – 1992. – Vol. 39. – P. 325–333.

10. Смирнов В.В., Смирнова-Залуми Н.С., Суханова Л.В. Микроэволюция байкальского омуля Coregonus autumnalis migratorius (Georgi) / Ред. В.Н. Большаков. – Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2009. – 246 с.

11. Правдин И.Ф. Руководство по изучению рыб (преимущественно пресноводных).– М.: Пищевая промышленность, 1966. – 376 с.

12. Cмирнов В.В. Динамика продуцирования рыб Байкала. – Новосибирск, 1983. – С. 201–223.

13. National Center for Biotechnology Information [Электронный ресурс]: база данных содержит мировую медико-биологическую и геномную информацию. - Bethesda MD, 20894 USA., 2012. — Режим доступа: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov, свободный. - англ.

14. Волерман И.Б., Конторин В.В. Биологические сообщества рыб и нерпы в Байкале / Ред. А.Г. Егоров. – Новосибирск: Наука, 1983. – 248 с.

15. Kulda J., Nohýnková E. Flagellates of human intestine and of intestines of other species. In: Kreier JP (ed). Parasitic Protozoa. Vol 2. Academic Press, New York, 1978. – P. 2–138.

16. Brugerolle G., Lee J.J. Order Diplomonadida. In: Lee JJ, Leedale GF, Bradbury P (eds). An Illustrated Guide to the Protozoa. 2nd ed. Society of Protozoologists, Lawrence, KS, 2002. – P. 1125–1135.

17. Woo P.T.K. Diplomonadida (Phylum Parabasalia) and Kinetoplastea (Phylum Euglenozoa) / In: Woo P.T.K. (ed). Fish Diseases and Disorders. Vol 1. 2nd edn. CAB International, 2006. – P. 46–115.

18. Kent M.L., Ellis J., Fournie J.W., Dawe S.C., Bagshaw J.W., Whitaker D.J. Systemic hexamitid (Protozoa: Diplomonadida) infection in seawater pen-reared Chinook salmon Oncorhynchus tshawytsha // Dis. Aquat. Org. – 1992. – Vol. 14. – P. 81–89.

19. Guo F.C., Woo P.T.K. Experimental infections of Atlantic salmon Salmo salar with Spironucleus barkhanus // Dis. Aquat. Org. – 2004. – Vol. 61. – P. 59–66.

20. Sterud E., Mo T.A., Poppe T.T. Ultrastructure of Spironucleus barkhanus N. Sp. (Diplomonadida: Hexamitidae) from Grayling Thymallus thymallus (L.) (Salmonidae) and Atlantic Salmon Salmo salar L. (Salmonidae) // Euk. Microbiol. – 1997. – Vol. 44. – P. 399–407.

21. Атлас и определитель пелагобионтов Байкала (с краткими очерками по их экологии) / Тимошкин О.А., Мазепова Г.Ф., Мельник Н.Г. и др. // Новосибирск: Наука. Сибирская издательская фирма РАН, 1995. – 694 с.