Гриднева В.В., Куликова И.Ю.
ФГОУ ВПО «Астраханский Государственный Технический
Университет», Россия
Исследование мезофильного и психрофильного микробного сообщества
Северного Каспия, способного к деструкции нефти и нефтепродуктов
Загрязнение
окружающей среды нефтью и нефтепродуктами приобретает глобальный характер. В
морских экосистемах повсеместно наблюдаются сброс и случайное попадание этих
соединений в природную среду в результате добычи, транспортировки и хранения
углеводородного сырья. Для защиты окружающей среды от загрязнений
нефтепродуктами существуют химические, физические и биологические методы. Наиболее
востребованными в последнее время являются экологически чистые
биотехнологические методы защиты. Эти методы основаны на использовании
микроорганизмов-деструкторов углеводородов. Микроорганизмы, развивающиеся в
местах нефтяного загрязнения, адаптированы к нефтяным углеводородам и обладают
более высоким углеводородокисляющим потенциалом в результате индукции
специфических ферментов и пластичности метаболизма [Leahy, 1990, p.
305-315]. Установлено, что решающую роль в процессе трансформации нефти и
нефтепродуктов до простых соединений выполняют микроорганизмы [Квасников, 1981,
с. 14-15], многие из которых способны разрушать углеводороды. Одним из важных
факторов, влияющих на способность микроорганизмов к разрушению нефти и нефтяных
углеводородов, является температура. Наиболее оптимальными для развития микроорганизмов
– деструкторов являются мезофильные условия, то есть 20 – 28 º С. При
температуре 6 – 15 º С интенсивность трансформации нефти снижается в 2,5 –
4 раза [Квасников, 1981, с. 72 – 73]. Уменьшение температуры воды на каждые 5 º С сопровождается непропорциональным
снижением биологической активности микроорганизмов [Петров, 1978, с. 52]. В связи
с этим актуальным является поиск и выделение аборигенных мезофильных и
психрофильных микроорганизмов, способных к деструкции нефти и нефтепродуктов, для
того чтобы процесс биоремедиации активно проводился при любой температуре.
Из
шельфовых вод Северного Каспия методом накопительных культур на жидких средах
Миллса, М-9, Чапека, МКД с добавлением нефти, дизельного топлива и керосина с
последующим высевом на плотные среды того же состава с вышеуказанными
нефтепродуктами были выделены 67 штаммов микроорганизмов. Инкубация
накопительных культур, выделение углеводородокисляющих микроорганизмов и
изучение их активности проводилась при температуре 6 º С для выявления
психрофилов и 28 º С для мезофилов.
Исследование активности штаммов по отношению к нефти, дизельному топливу
и керосину проводили методом лунок по
Егорову [Руководство к практическим занятиям, 1983, с. 135]. В результате были
отобраны 26 мезофильных и 5 психрофильных штаммов, наиболее активно
развивающихся в присутствии нефти и нефтепродуктов. Деструктивную активность
штаммов по отношению к сырой нефти изучали на стерильной морской воде. Стерильную
нефть вносили в количестве 1% по отношению к объему морской воды, суспензии
исследуемых штаммов вносили по 2%. Титр клеток составлял 106-107
кл/мл. Содержание нефтепродуктов в эксперименте определяли гравиметрическим
методом после 15 суток экспозиции, в качестве элюента использовали хлороформ [Белоусова,
2002, с. 514]. Убыль углеводородов определяли по отношению к контролю без
внесения штаммов, который имитировал убыль нефтяных фракций за счет
физико-химических процессов.
В результате проведенного эксперимента
установлено, что среди мезофильных микроорганизмов 22 штамма в различной степени способны к деструкции нефти (рис.
1). Наибольшую активность проявляли штаммы № 1, 15, 16, 23, вызывающие более
40% убыль нефти. Меньшей активностью обладали штаммы № 3, 8, 13, 20, 25 разлагающие
от 30 до 40 % нефти. Установлено, что психрофильные штаммы также способны к деструкции нефти, но в меньшей степени, чем
мезофильные. Среди них три штамма (П1, П4, П5) оказались наиболее активными,
утилизируя от 13,5 до 26 % нефти.
Рисунок 1. Деструкция сырой
нефти мезофильными (М 1 – М 26) и психрофильными (П 1 – П 5) штаммами за 15 сут
экспозиции
Нерастворимость нефти в воде в значительной
степени препятствует проникновению ее в клетки микроорганизмов для дальнейшего
усвоения. Поэтому большое значение имеет степень диспергированности
углеводородов в среде. Некоторые углеводородокисляющие микроорганизмы
продуцируют эмульсифицирующие агенты (биоэмульсификаторы, биосурфактанты),
которые способны снижать поверхностное натяжение и повышают их способность
деградировать углеводороды [Гоготов, 2005, с. 54].
Эмульгирующую активность выделенных штаммов
определяли методом методом Купера [Cooper, 1987, Р. 226]. В
качестве гидрофобной фазы для эмульгирования использовали керосин, бензин и
дизельное топливо. Эксперимент проводился при температуре 6 º С для
психрофилов и 28 º С для мезофилов. Измерение индекса эмульгирования
определяли через 24 ч как величину отношения высоты эмульсионного слоя к общей
высоте жидкости в пробирке и выражали в процентах. Исследование эмульгирующих
свойств культуральных жидкостей показало, что индекс эмульгирования при
смешивании с керосином, бензином и дизельным топливом различен. Среди мезофилов
5 штаммов не обладали эмульгирующими свойствами, 14 штаммов отличались высокой
эмульгирующей активностью (до 59 %). Причем большинство штаммов активнее
эмульгировали керосин (от 3 до 59 %), 10 штаммов обладали способностью к
эмульгации всех тестируемых нефтепродуктов (таб. 1). Среди психрофилов два
штамма обладали высокой эмульгирующей активностью по отношению к дизельному
топливу, один штамм - к керосину. Наибольшую активность проявляет штамм № П5.
Таблица
1. Индекс
эмульгирования исследуемых мезофильных (М 1 – М 26) и психрофильных (П 1 – П 5)
штаммов, %
|
№ штамма |
керосин |
дизельное топливо |
бензин |
|
М 1 |
53 |
36,6 |
6,3 |
|
М 2 |
12 |
34 |
40 |
|
М 3 |
58,8 |
17,6 |
46,7 |
|
М 4 |
5,6 |
2,8 |
0 |
|
М 5 |
0 |
15 |
0 |
|
М 6 |
0 |
0 |
0 |
|
М 7 |
45 |
22,2 |
22,7 |
|
М 8 |
35,5 |
5,2 |
48,2 |
|
М 9 |
0 |
0 |
0 |
|
М 10 |
0 |
0 |
0 |
|
М 11 |
47 |
0 |
0 |
|
М 12 |
11,1 |
0 |
53,3 |
|
М 13 |
52,6 |
58,8 |
47,5 |
|
М 14 |
10 |
0 |
4,1 |
|
М 15 |
43 |
2,9 |
12 |
|
М 16 |
31 |
50 |
32 |
|
М 17 |
3,1 |
0 |
5 |
|
М 18 |
3,1 |
45,5 |
17 |
|
М 19 |
46,2 |
42,2 |
43,3 |
|
М 20 |
6,7 |
7,1 |
1,2 |
|
М 21 |
46,7 |
50 |
36 |
|
М 22 |
0 |
0 |
0 |
|
М 23 |
25 |
36,7 |
6,1 |
|
М 24 |
2,9 |
2,5 |
50 |
|
М 25 |
13,9 |
10 |
30 |
|
М 26 |
10 |
3,1 |
0 |
|
П 1 |
1,7 |
0 |
1,2 |
|
П 2 |
8,2 |
20,1 |
7,1 |
|
П 3 |
12,5 |
33,3 |
12,3 |
|
П 4 |
9 |
1,9 |
2,5 |
|
П 5 |
0 |
1,9 |
0 |
Таким образом, в результате проведенного
скрининга углеводородокисляющих микроорганизмов Северного Каспия выделены как мезофильные,
так и психрофильные микроорганизмы, обладающие способностью к деструкции нефти
и нефтепродуктов, а также высокой эмульгирующей активностью, что делает их
перспективными объектами биотехнологии в области защиты окружающей среды от нефтяного
загрязнения.
Литература
1.
Белоусова
Н.И. Отбор микроорганизмов, способных к деструкции нефти и нефтепродуктов при
пониженных температурах / Белоусова Н.И., Барышникова Л.М., Шкидченко А.Н. //
Прикладная биохимия и микробиология, 2002, т. 38, №5, с. 513-517.
2. Гоготов И.Н.
Полисахариды: свойства, получение и практическое использование. В: Материалы
межд. научно - практич. конф. «Перспективы и проблемы развития биотехнологии в
рамках единого пространства стран содружества», Минск - Нароч: РИВШ, 2005. С. 54-55.
3.
Квасников
Е.И. Микроорганизмы – деструкторы нефти в водных бассейнах / Е.И. Квасников,
Т.М. Клюшникова, Киев, Наук.думна, 1981, 131 с.
4.
Петров
Г.Н. Некоторые физические процессы самоочищения воды от нефти //
Гидробиологический журнал, 1978, Т. XVI, №4, с. 52 - 54.
5.
Руководство
к практическим занятиям по микробиологии: Практическое пособие /Под ред.
Н.С.Егорова.- 2-е изд.-М.: Изд-во Моск.ун-та, 1983.- 251с.
6. Cooper D.G., Goldenberg b.G. // Appl. Environ. Microbial. 1987. V. 53. №
2. Р. 224-229.
7. Leahy J.G., Colwell R.R. Microbial dеgradation of
hydrocarbons in the environment // Microbiol. Rev. - 1990. - vol.54. - p.
305-315.