Новый природный изолят энтомопатогенных нематод активный при низких температурах

Биологические науки/6. Микробиология

д.с.х наук Данилов Л.Г.,

д. б.наук, академик Павлюшин В.А.,

н.с. Нащекина Т.Ю.,

к.б.н. Айрапетян В.Г.

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений

Успешность использования энтомопатогенных нематод (ЭПН) семейств Steinernematidae и Heterorhabditidae против целевых объектов во многом определяется знаниями закономерностей поведения инвазионной стадии нематод в изменяющихся температурных условиях окружающей среды. Биологические препараты, изготавливаемые на основе энтомопатогенных нематод, в основном предназначены для борьбы с различными стадиями развития насекомых, обитающих в почве. Результаты испытаний как отечественных, так и зарубежных аналогов нематодных препаратов, свидетельствуют о существенных ограничениях возможностей применения этих препаратов с понижением температуры почвы ниже 15 ⁰С.

В мировой практике проводятся интенсивные генетические исследования по повышению толерантности и активности ЭПН в изменяющихся температурных условиях в местах их обитания и, особенно, в сторону низких температур (Griffin and Downes, 1991, 1994; Grewal et al.,1996; Schirocki and Hague, 1997; Ehlers et al., 2005). В экспериментальных условиях скринингом на определенной стадии отбора достигаются некоторые изменения в холодовой реакции отдельных штаммов нематод, однако по неизвестным причинам в дальнейшем этот показатель восстанавливается на первоначальный уровень.

Более успешны исследования по поиску и отбору природных адаптированных к холоду штаммов ЭПН (Hazir et al., 2001). Отобранные таким образом штаммы регистрируются в качестве основы новых биологических препаратов (Fridlender and Ricci, 1999).

С целью выделения холодостойких изолятов ЭПН из природных популяций, перспективных в использовании в качестве биологических агентов против насекомых, связанных с пребыванием в почве, на одной из фаз развития связанных с пребыванием в почве и, особенно против жесткокрылых, нами были проведены исследования по изучению особенностей поведения энтомопатогенных нематод, встречающихся в естественных условиях различных географических зон в присутствии насекомых-хозяев. Работа выполнена в рамках Госконтракта № 16.М04.12.0027 по теме «Разработка биоинсектицидов для борьбы с жесткокрылыми насекомыми – вредителями сельскохозяйственных культур и запасов».

В опытах использовались следующие культуры и штаммы нематод: S.carpocapsae штамм "agriotos" - выделен из щелкунов в 1974 в Ленинградской области; S. feltiae Filipiev (= S. bibionis) - австралийский штамм; S. feltiae protense subsp.n. (Иванова, Данилов, Ивахненко, 2001) - выделен из почв аласов в Якутии; H. bacteriophora Poinar - австралийский штамм, H. bacteriophora Poinar - выделен из почв садов в Ростовской области.

Особенности поведения инвазионных личинок нематод при различных температурах оценивали путём заражения тест-насекомых: гусениц большой вощинной моли Galleria mellonella L. и гусениц смородинной стеклянницы Synanthedon tipuliformis Cl. Инвазионную активность нематод оценивали по интенсивности гибели зараженных насекомых и интенсивности проникновения паразитов в тело хозяина (Веремчук, Данилов, 1978; Glaser, et al.,1991).

Все виды и штаммы нематод испытывали в 4 дозах: 10, 30, 60 и 90 личинок на чашку Петри с 10 насекомыми в каждой. В контроле вносили на фильтры воду без нематод.

Гибель насекомых учитывали через каждые 4 часа после начала заражения. Во время учётов погибших насекомых выбирали из чашек, вскрывали и определяли причину их гибели. Обнаруженных нематод подсчитывали и, таким образом, устанавливали интенсивность их проникновения в хозяина. Инвазионная активность энтомопатогенных нематод оценивалась по показателю LD₅₀. В опытах линеаризацию зависимости доза - эффект проводили по алгоритму симметризации (Васильев и др., 1973). .

Результаты оценки инвазионной активности энтомопатогенных нематод по показателю LD₅₀ в отношении гусениц смородинной стеклянницы свидетельствуют о существенном влиянии температуры на процесс инвазирования хозяина различными видами и штаммами нематод (табл. 1).

Таблица 1.

Влияние температуры на инвазионную активность энтомопатогенных нематод в отношении гусениц смородинной стеклянницы (в скобках- доверительные интервалы доз на уровне p ≤ 0,05)

Вид нематод	LD₅₀ нематод при температурах
Вид нематод	13^оС	25^оС	28^оС
S. carpocapsae	73 (70,8 - 75,1)	15 (12,9 - 17,2)	8 (5,9 - 10,2)
S. feltiae	85 (82,9 - 87,1)	25 (22,9 - 27,2)	10 (7,9 -12,2)
S.feltiae protense subsp.n	25 (22,9 - 27,2)	25 (22,9 - 27,2)	20(17,9- 22,2)
H. bacteriophora	90 (78,8 - 109,4 )	40 (337,9 - 42,2)	30 (27,9 - 32,2)
Heterorhabditis sp.	94 (75,9 - 112,1)	38 (35,9 - 40,1)	39 (36,9 -41,2)

Полученные нами данные показывают, что при температуре 13^оС наиболее низкая LD₅₀ для гусениц стеклянницы была у культуры нематод S. feltiae protense subsp.n. выделенной из почв аласов республики Саха- Якутия.

Особенности проявления инвазионной активности у культуры нематод из Якутии побудили нас к постановке специальных экспериментов по определению истинных температурных пределов проявления жизнедеятельности у инвазионных личинок этого изолята с использованием математического моделирования показателей зависимости смертности насекомых-хозяев от условий заражения (температуры, дозы инвазии).

Для сравнительной оценки в модельном опыте были использованы в качестве тест-насекомых гусеницы большой вощинной моли и две культуры нематод - S. carpocapsae штамм "agriotos", на основе которой изготавливается препарат НЕМАБАКТ и S. feltiae protense subsp.n.(далее в тексте даются только видовые названия этих штаммов), показавшие наибольшие поведенческие различия по результатам испытаний их на гусеницах смородинной стеклянницы.

Методика проведения опыта была аналогичной испытаниям инвазионной активности нематод на гусеницах смородинной стеклянницы. Виды нематод испытывали в 3 дозах: 10, 50 и 90 инвазионных личинок на чашку Петри при 5 градациях температуры- 6, 9, 12, 20 28^оС. Все варианты опытов и контролей имели 4-х -кратную повторность.

На основании полученных экспериментальных данных установлено, что интенсивность гибели тест-насекомых зависит от абсолютного количества нематод, проникших (инвазировавших) в тело насекомого. Для двух тестируемых видов энтомопатогенных нематод S . carpocapsae и S. feltiae эта зависимость хорошо описывается степенной функцией. Для S. feltiae математическая модель, описывающая эту зависимость имеет вид: y₁= 16,4 × N^0,5 ± 9 (1).

Для S. carpocapsae: y₂ = 14,5 × N^0,5 ± 9, (2)

где y₁ и y₂ - смертность G. mellonella (в процентах) для S. feltiae и S. carpocapsae, соответственно, N - абсолютное количество проникших нематод. Точность этих моделей довольно высокая. Коэффициент корреляции между уровнем смертности и количеством проникших в насекомых нематод равен 0,960, т.е. (иными словами) модели адекватно оценивают уровень смертности в 92% случаях (r = 0,92). В результате проведенного эксперимента установлено, что 50% смертность G. mellonella отмечается при проникновении 9 особей S. feltiae и 12 - у S. carpocapsae. Более детальный сравнительный анализ интенсивности проникновения инвазионных личинок двух видов нематод в насекомых позволяют провести данные, представленные в таблице 2.

Таблица 2.

Дозы нематод и температуры, обеспечивающие проникновение инвазионных личинок S. feltiae и S.carpocapsae на уровне LD₅₀ для G.mellonella.

Доза нематод

Температура, ^о С

6 - 20

6 - 28

20 - 28

12 - 28

Вид нематод

S. feltiae

S. carpocapsae

Анализ данных показывает, что S. feltiae по сравнению с S.carpocapsae характеризуется не только более высокой патогенностью, но прежде всего тем, что эта патогенность проявляется в гораздо более широком диапазоне температур (от 6 до 28^о для S. feltiae и от 12 до 28^о для S.carpocapsae).

Значительный интерес представляют результаты изучения особенностей проявления инвазионной активности двух культур нематод по гибели тест-насекомых в зависимости от температуры и численности инвазионных личинок в зоне обитания насекомых (рис. 1).

Рис. 1.

Смертность G.mellonella при разных температурах и дозах для двух видов нематод

Максимальная смертность насекомых при заражении S. feltiae отмечалась при температурах 12-20^оС. При температуре 28^оС она резко снижалась. При заражении S. carpocapsae максимальный уровень смертности отмечен при температуре 28^оС.

Интересно отметить, что начало периода смертности и её продолжительность не зависели от дозы нематод и определялись только температурными условиями.

Как видно из проведенного анализа смертность насекомого-хозяина, а следовательно и инвазионная активность нематод в большей степени определяется температурным фактором. Максимальная инвазионной активность S.feltiae проявляется в зоне температур от 12 до 23⁰С. Также характерно для этого вида нематод при заражении насекомых-резкое падение смертности при температуре выше 20^ои, в тоже время, уровень смертности тест-насекомых при заражении их нематодами S.feltiae в пределах температур 6 и 9^оС относительно высок (43-45%).

Таким образом, S. feltiae protense subsp.n характеризуется не только лучшими показателями по инвазионной активности, но и большей вирулентностью в отношении насекомым, которая к тому же, проявляется в более широком диапазоне температур от 6 до 28^оС. Указанные различия у двух видов нематод свидетельствуют и о большей биологической эффективности и перспективности S. feltiae protense subsp.n по сравнению с S. carpocapsae штамм "agriotos".

Список литературы

1. Веремчук Г.В.,Данилов Л.Г. Методические указания по определению инвазионной активности нематодных культур рода Neoaplectana (Steinernematidae). Ленинград, 1978, 7 с.

2. Васильев С.В., Поляков И.Я., Сергеев Г.Е. Теория и методы использования математического моделирования и ЭВМ в защите растений. Тр. ВИЗР,1973, Вып.39.с. 61-106.

3. Иванова Т.С., Данилов Л.Г., Ивахненко О. А. Новый подвид энтомопатогенных нематод семейств Steinernema feltiae protense subsp. N. (Nematoda: Steinernematidae) из Якутии. Паразитология , 2001,вып. 35, №4, стр. 333-337.

4. Bertold F. and Manuele R.. New entomopathogenic nematodes active at low temperatures. Bio Integreted Technology. 1999. WO 9955161 (A).

5. Ehlers, R. U., Oestergaard, J., Hollmer, S., Wingen, M. and Strauch, O. (). Genetic selection for heat tolerance and low temperature activity of the entomopathogenic nematode-bacterium complex Heterorhabditis bacteriophora-Photorhabdus luminescens. Biocontrol. 2005, 50, p. 699-716.

6. Glaser I., Galper S., Sharon E. Virulence of the nematode (Steinernematids and Heterorhabditids) - bacteria (Xenorhabdus spp.) complex to the Egyptian cotton leafworm Spodoptera littoralis (Lepidoptera: Noctuidae) J. Invertebr. Patholog. 1991, Vol. 57, № 3, p. 94-100.

7. Grewal, P. S., Gaugler, R. and Shupe, C. Rapid changes in thermal sensitivity of entomopathogenic nematodes in response to selection at temperature extremes. J. Invertebr. Pathol. 1996, 8, p. 73.

8. Griffin, C. T., and Downes, M. J.. Low temperature activity in Heterorhabditis sp. (Nematoda: Heterorhabditidae). Nematologica, 1991, 37, p.83 –91.

9. Griffin, C. T. and Downes, M. J. Selection of Heterorhabditis sp. for improved infectivity at low temperatures. In Genetics of Entomopathogenic Nematode-Bacterium Complexes (ed. A. M. Burnell, R. U. Ehlers and J. P. Masson), 1994, p . 120- 128. Luxembourg: European Commission Publication EUR 15681 EN.

10. Hazir S., Stock S. P, Kaya H. K., Koppenhofer A. M., and Keskin N. Developmental Temperature Effects on Five Geographic Isolates of the Entomopathogenic Nematode Steinernema feltiae (Nematoda: Steinernematidae) Journal of Invertebrate Pathology, 2001, 77, p. 243–250

11. Schirocki, A. G., and Hague, N. G. M.. The effect of selective culture of Steinernema feltiae at low temperature on establishment, pathogenicity, reproduction and size of infective juveniles.Nematologica, 1997, 43, p. 481–489.