Медицина/ 6.Экспериментальная и клиническая фармакология

Гребнева О.Л., Ковинька М.А., Силантьева Т.А., Горбач Е.Н.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. академика Г.А. Илизарова Минздравсоцразвития», Россия, г. Курган

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ДЕРИВАТОВ КРОВИ В СОСТАВЕ МАЗИ ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ

РЕПАРАТИВНЫХ ОСТЕО-, КЕРАТО- И ДЕРМОГЕНЕЗА

Ранее проведенные исследования показали эффективность внутритканевого введения полипептидных компонентов сыворотки/плазмы крови доноров с активным остеогенезом [1, 3]. Целью настоящего исследования явилось изучение действия компонентов сыворотки крови с заданными физико-химическими свойствами на репаративную регенерацию кости и кожи при их аппликациях в составе средства для наружного применения.

Эксперименты были выполнены на 40 белых лабораторных мышах самцах массой 22-27 г, которые были объединены в 4 экспериментальные группы, по 10 животных в каждой (таблица 1). Моделирование перелома ребра проводили по разработанной методике через полнослойный разрез покровных и мышечных тканей длиной 6 мм [2]. Животным всех групп, за исключением группы «контроль 1», выполняли накожные мазевые аппликации в области оперативного вмешательства один раз в день со 2-х по 9-е сутки после операции.

Таблица 1

Распределение животных по группам

Группа	Воздействие
Контроль 1	Операция по моделированию перелома ребра
Контроль 2	Операция + (суспензия тизоля)
Опыт 1	Операция + (суспензия тизоля + 0,6% фракция плазмы крови)
Опыт 2	Операция + (суспензия тизоля + 1,2% фракция плазмы крови)

Донорами крови были 10 белых лабораторных мышей, которым за трое суток до забора крови осуществляли закрытый перелом костей голени. Выделение фракции плазмы крови включало процедуры солевой преципитации, гель-проникающей и ионообменной хроматографии, а также лиофилизацию. В качестве мазевой основы средства для наружных аппликаций использовали фармакопейный препарат «Тизоль», разрешенный к медицинскому применению [4]. Через 10 суток эксперимента проводили эвтаназию животных и выделяли фрагменты ребер и кожного покрова области выполнения оперативного вмешательства. Проводили светооптические гистологические и гистоморфометрические исследования, включающие подсчет количества клеток хондробластической и остеобластической линий дифференцировки периостального регенерата в поле стандартной площади. Сравнительную оценку состояния кожного покрова проводили с использованием описательной световой микроскопии и полуколичественным методом. Подсчитывали число рядов клеток в эпидермисе, оценивали васкуляризацию, клеточность дермы кожного регенерата и наличие в нем дериватов. Гистоструктурные изменения оценивали по шкале от ^{сильно выраженных изменений вплоть до их отсутствия.} Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического критерия Вилкоксона для независимых выборок с принятием критического уровня значимости равным 0,05.

У всех животных в интермедиарной части зоны сращения перелома располагалась рыхлая, реактивно измененная, волокнистая соединительная ткань, бесструктурные массы детрита. На периостальной поверхности ребра формировалась объемная костно-хрящевая мозоль. Новообразованная грубоволокнистая костная ткань наблюдалась в виде тонкого слоя на поверхности компактной пластинки кости и в составе перихондрально образованных костных трабекул. Применение только мазевой основы «Тизоль» (группа «контроль 2»), а также фракции плазмы крови в большей концентрации (группа «опыт 2»), не оказывают статистически значимого влияния на численность клеток обоих типов (табл.2). В группе «опыт 1» отмечено значимое увеличение процентного количества остеоцитов, что позволяет говорить о выраженном остеоиндуцирующем эффекте в данной группе эксперимента.

Таблица 2

Количество клеток костной (Остеоциты) и хрящевой (Хондроциты) тканей на единицу площади периоста (0,0025 мм²)

Группа	Характеристика	Остеоциты	Хондроциты
Контроль 1	Медиана	0,733	7,32
	25 процентиль	0,533	6,58
	75 процентиль	0,983	7,38
Контроль 2	Медиана	0,633	6,1
	25 процентиль	0,617	5,7
	75 процентиль	0,683	7,67
Опыт 1	Медиана	2,60^*	5,33
	25 процентиль	2,217	5,07
	75 процентиль	3,05	5,48
Опыт 2	Медиана	0,317	6,25
	25 процентиль	0,3	6,15
	75 процентиль	0,417	7,6

* Достоверность различия результатов между группами: выделение жирностью – от значений контроля 1 (р<0,02), чертой – от контроля 2 (р<0,05).

Данные анализа состояния кожных покровов свидетельствуют о том, что к нормальному строению были наиболее приближены регенераты кожного покрова животных опытных серий эксперимента, что было наиболее выраженным у животных серии «опыт 2» (таблица 3).

Таблица 3

Полуколичественная оценка гистоструктурных компонентов кожного покрова в области повреждения ребра

Серии эксперимента	Число рядов клеток в эпидермисе	Клеточность в дерме	Наличие дериватов	Васкуляризация
Контроль 1	5-8	^+++*	^―	^±
Контроль 2	7-9	^+++	^―	^+
Опыт 1	4-6	^++	^±	^+
Опыт 2	3-5	^+	^++	^+
Норма	1-2	^±	^+++	^++

^{*Степени выраженности признака: (+++) – сильная, (++) – умеренная, (+)– слабая, (±) – очень слабая. (―) – отсутствие признака.}

По результатам исследования можно сделать следующие выводы.

1. Мазевая основа Тизоль не оказывает достоверного влияния на гистоморфологические показатели животных-реципиентов.

2. 0,6%-ная концентрация компонентов крови стимулирует периостальный остеогенез в области перелома, не влияя на репаративную регенерацию компонентов кожи.

3. 1,2%-ная концентрация компонентов крови ускоряет восстановление гистоструктуры кожного покрова, не влияя на показатели регенерации тканей в области перелома.

Данные литературы позволяют предположить, что активность выделенной нами фракции плазмы крови обусловлена наличием в ней факторов роста и интерлейкинов, участвующих в обеспечении местных пролиферативных процессов. Общими стимуляторами для регенерации кости и кожи являются множество цитокинов: трансформирующие факторы роста (ТФР), фактор роста эндотелия сосудов, тромбоцитарные факторы роста, факторы роста фибробластов и другие [5 – 9]. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования различных доз компонентов плазмы крови от доноров с активным остеогенезом в составе средства для наружного применения у групп пациентов с повреждением кости и кожных покровов. 

Литература

1. Гребнева, О.Л. Влияние остеоиндуктивных компонентов плазмы крови на гематологические показатели у мышей / О.Л. Гребнева, М.А. Ковинька, С.П. Изотова // Гений ортопедии. – 2005. - № 3. – С. 58-61.

2. Гребнева, О.Л. Экспериментальная модель для изучения процессов репаративного остеогенеза / О.Л. Гребнева, М.А. Ковинька, Т.А. Силантьева, О.В. Дюрягина, Л.И. Сбродова, Е.И. Кузнецова, Л.В. Розова, М.В. Стогов, Е.А. Ткачук // Сибирский медицинский журнал (Томск). – 2011. – № 1, вып.1. – С. 135-139.

3. Патент 2193868 Российская Федерация, МПК ⁷ А 61 В 17/56, А 61 Р 5/50. Способ стимуляции репаративного остеогенеза / Десятниченко К.С., Ларионов А.А., Гребнева О.Л., Ерофеев С.А., Ковинька М.А., РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова (РФ). - № 98105940/14; Заявл. 26.03.1998, Опубл. 10.12.2002, Бюл. № 34.

4. Смагина, Т.А. Перспективы использования в медицине аквакомплекса глицеросольвата титана и препаратов на его основе / Т.А. Смагина, Б.Н. Бекетов // Бюллетень сибирской медицины. - 2006. - Приложение 2. - С. 131-132.

5. Щепеткин, И.А. Полипептидные факторы остеогенеза / И.А. Щепеткин // Усп.совр.биол. - 1994. - Т.114, вып.4 - С.454-466.

6. Mohan, S. Bone growth factors / Mohan S., Baylink D.J. // Clin.Orthop.and Rel.Res. - 1991. - No.263 (Febr.). - P.30-48.

7. Regeneration of Class III furcation defects with basic fibroblast growth factor (b-FGF) associated with GTR. A descriptive and histometric study in dogs / Rossa C., Marcantonio E., Cirelli J.A., Marcantonio R.A., Spolidorio L.C., Fogo J.C. // J. Periodontol. – 2000. – Vol. 71, No 5. – P. 775-784.

8. Singer, A.J. Cutaneous wound healing / Singer A.J., Clark R.A. // N. Engl. J. Med. – 1999. - N 341. – P.738-746.

9. Skeletal defects in VEGF(120/120) mice revealmultiple roles for VEGF in skeletogenesis / E. Zelzer, W. McLean, Y. S. Ng, N. Fukai, A. M. Reginato, S. Lovejoy, P. A. D'Amore, B. R. Olsen //Development. – 2002. – V. 129, № 8. – P. 1893–1904.