Медицина/ 8. Морфология

Московский С.Н., Коршунов А.С., Хамов М.А., д.м.н., проф. Конев В.П., к.м.н. Шестель И.Л., Марковский С.О.

ГБОУ ВПО Омская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития, г. Омск

МУЗ ГКБ №11, отделение челюстно-лицевой хирургии, г. Омск

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ В ИЗУЧЕНИИ ПЛОТНЫХ ТКАНЕЙ ОРОФАЦИАЛЬНОЙ ОБЛАСТИ

Исследования клеточных структур микроскопическими методами на сегодняшний день являются основополагающими для диагностики патологических процессов, и главным из них остается оптическая микроскопия. При исследовании костной ткани и твердых тканей зубов, несмотря на необходимость придерживаться строгой последовательности методики изготовления микропрепаратов, требующей длительного периода времени для лучших результатов одновременной фиксации и декальцинации оптическая микроскопия, остается, чуть ли не единственным способом оценки патологических изменений, даже не учитывая некоторые неизбежные изменения (набухание коллагеновых структур, микроразрушения кристаллической решетки гидроксиапатитов), что нежелательно, особенно в случаях патологии соединительной ткани.

Помимо рутинных методов микроскопии, лежащих в основе всех исследовательских программ, для изучения ультраструктур клетки и клеточных мембран в настоящее время используются электронная микроскопия и сканирующая, зондовая микроскопия. Метод электронной микроскопии известен давно, в то время как методы сканирующей микроскопии развиваются не более 2 десятилетий. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) применяется для исследования гистологических препаратов пока чрезвычайно редко: стандартные способы подготовки образцов для АСМ позволяют исследовать поверхность образца, но не его внутреннюю структуру.

Сканирующая туннельная микроскопия и АСМ являются наиболее перспективными представителями сканирующей зондовой микроскопии, причем она не требует обязательной электрической проводимости исследуемых образцов, то есть образцы не нуждаются в предварительной обработке.

Цель работы. Изучить возможности применения АСМ для морфологической диагностики патологии соединительной ткани по твердым тканям зубов и костной ткани.

Материалы и методы исследования.

Для исследования на базе Омского государственного технического университета кафедры «Оборудования и технологии сварочного производства» с использованием полировально – шлифовального станка Нейрис, шлифовальных кругов hermes с разной степенью зернистости, и полировальных кругов с алмазной суспензией Akasel, разного количества микрон. Отсмотр образцов осуществлялся на оптическом микроскопе марки Olympus jx 41, с увеличением 1000крат, при этом изучалось микроскопическое строение костной ткани и эмали зубов нижней челюсти. Ультраструктурное строение изучалось на базе Омского государственного университета кафедры «Прикладной и медицинской физики», с использованием сканирующего зондового микроскопа Solver Pro (NT – MPT, Россия). Анализ образцов АСМ–изображения осуществлялся с использованием программного модуля обработки изображения Image Analysis NT – VDT.

Морфологическое исследование выполнено на 57 зубах, которые были консервированы после удаления, одномоментно помещались в нейтральный 10% раствор формалина.

По разработанной методике подготовки образцов для 8 зубов нижней челюсти, подготовлены шлифы, обработки поверхности медиального щечного бугра с помощью шлифовальных, полировальных кругов и травления ортофосфорной кислотой системы марки «Evicrol». Полученные образцы зубов помещались в поле зрения оптического микроскопа, с последующим АСМ – микроскопированием. В результате были получены цифровые снимки зубов у обследуемых лиц, по которым осуществлялся анализ степени упаковки и форму эмалевых призм, размер эмалевых призм, размер межпризменного промежутка и его высоту, размер оболочки эмалевых приз у группы контроля и лиц с патологией соединительной ткани.

Морфологическое исследование 57 костных объектов (нижняя челюсть) было выполнено с применением описанной выше методики.

Результаты.

Таблица №1

Качественные характеристики эмалевых призм у обследуемых лиц (оптическая микроскопия)

Группы обследуемых лиц	Общая характеристика	Форма эмалевых призм
группа пациентов без ДСТ (n = 25)	Постоянство	Аркообразные (полукруглые); шестигранные, семигранные
группа пациентов с ДСТ (n = 30)	Вариабельность	Аркообразные, Квадратные, прямоугольные, остроконечные, пятигранные, шестигранные

По качественным характеристикам костной ткани плотное вещество состоит из тонких костных пластинок, границы которых на поперечных шлифах кости выступают весьма четко, так как полости костных пластинок в плотном костном веществе располагаются, как правило, между соседними пластинками. Местами костные пластинки соприкасаются друг с другом, местами же между ними располагаются вставочные пластинки. При этом по качественным характеристикам эмалевых призм, у лиц без патологии соединительной ткани имеют постоянство структуры в виде упорядоченных шестигранных и даже семигранных, с аркообразными формами эмалевые призмы. В исследуемой группе с патологией соединительной ткани призмы расположены хаотично, они имеют и пятигранную и шестигранную структуру, с разнообразными формами в виде различных геометрических фигур.

Таблица №2.

Количественные характеристики минерального матрикса эмали зубов у обследуемых лиц (зондовая микроскопия)

Параметры / Группы обследуемых лиц	Размер эмалевых призм в горизонтальной плоскости (dх), микрон	Размер эмалевых призм в вертикальной плоскости (dу), микрон	Количество эмалевых призм в ед. объема (10*10 микрон)	Расстояние между эмалевыми призмами, наномикрон	Величина оболочки призмы, микрон	Высота межпризменного промежутка наномикрон
Группа пациентов без ДСТ (n = 27)	6,3 ± 0,2	6,25 ± 0,3	6,2 ± 0,2	0,32±0,02	0,19±0,03	19,8 ± 2,5
Группа пациентов с ДСТ (n = 30)	5,5 ± 0,3	5,4 ± 0,1	5, 2± 0,1	1,5 ± 0,1	0,8 ± 0,2	84,5 ± 2,9

Примечание: р<0,05

При зондовой микроскопии эмали зубов на нижней челюсти видно, что у лиц с патологией соединительной ткани эмалевые призмы отличаются меньшими размерами, как в горизонтальной, так и вертикальной плоскостях. Параллельно этому следует уменьшение эмалевых призм в единице объема, что говорит о менее плотной их упаковке. Достоверное увеличение расстояния между эмалевыми призмами, увеличение высоты межпризменного промежутка у данной категории пациентов говорит об увеличение общей доли органического вещества в полностью прорезовшихся зубах. Величина оболочки эмалевой призмы у лиц с патологией соединительной ткани отличается большими размерами (табл.2).

Таблица №3.

Количественные характеристики минерального матрикса у обследуемых лиц (зондовая микроскопия)

Параметры / Группы обследованных	Размер коллагеновых волокон в горизонтальной плоскости (dх), нм	Размер коллагеновых волокон в вертикальной плоскости (dу), нм	Размер минеральных пластин в горизонтальной плоскости (dх), нм	Размер минеральных пластин в вертикальной плоскости (dу), нм
группа пациентов без ДСТ (n = 28)	61,4 ± 9,5	98,7 ± 23,3	61,4 ± 9,5	5,4 ± 1,3
группа пациентов с ДСТ (n = 33)	34,7 ± 19,4	56,0 ± 21,4	74,7 ± 39,4	9,0 ± 2,3

Примечание: р<0,05

При зондовой микроскопии костной ткани нижней челюсти видно, что молекулы коллагена не связаны между собой "конец в конец", а между ними имеется промежуток в 35 - 40 нм. Предполагается, что в костной ткани эти промежутки выполняют роль центров минерализации, где откладываются кристаллы фосфата кальция. При атомно-силовой микроскопии фиксированные и контрастированные фибриллы коллагена выглядят поперечно исчерченными с периодом 67 нм, который включает одну тёмную и одну светлую полоски, с диаметром в среднем 100 нм. Считают, что такое строение максимально повышает сопротивление всего агрегата растягивающим нагрузкам. При этом, у лиц с патологией соединительной ткани, мы наблюдали, что сопоставимые измерения длины и поперечника коллагеновых волокон сильно варьировали, с увеличением промежутка между волокнами до 80нм (в среднем 67нм), и уменьшения поперечного размера волокон до 60нм (в среднем 100нм).

При этом, сопоставление размеров минеральных пластин между коллагановыми волокнами в костной ткани нижней челюсти как у лиц с патологией соединительной ткани, так и в группе сравнения, статистически достоверной разницы не наблюдалось (табл. 3)

При оценке результатов исследования костной ткани видно, что основным различием между группой контроля и пациентами с патологией соединительной ткани является наличие пустот, что влечет за собой изменения структуры залегания минеральных элементов кости, изменение формирования костных пластинок, а также изменение количества минеральных компонентов в единице объема кости.

По результатам исследования эмали зубов видно, что основным различием между группой контроля и пациентами с патологией соединительной ткани является наличие гипоминерализованной структуры кристаллической решетки гидроксиапатитов, неправильной их пространственной ориентацией, что влечет за собой изменение залегания органического матрикса, нарушение формирования полноценной структуры эмали, вследствие нарушения нормального взаимоотношения органического матрикса и минерального компонента, несвойственных данному периоду созревания эмали зубов.

Выводы.

По результатам исследования ультраструктуры и минерального состава можно говорить о нарушении минерализации и организации эмали зубов и костной ткани у лиц с признаками патологии соединительной ткани. Это объясняется недостаточно плотной упаковкой эмалевых призм, костных пластинок в единице объема, их хаотичным расположением, недостаточно организованным и минерализованным органическим матриксом.

Исследования срезов на АСМ дают возможность получать изображения, сопоставимые с малым увеличением (менее ~25000) просвечивающего электронного микроскопа. Дальнейшее развитие методик позволит использовать АСМ как основной метод исследования тканей, используемый в сочетании с другими видами микроскопии.

Достоинством этого метода является возможность изучения микрорельефа поверхности без предварительной обработки, деформирующей клеточные структуры.

Результаты демонстрируют возможность использования АСМ для изучения нативных клеточных культур, в т.ч. твердых тканей зуба и костной ткани как в судебно-медицинской так и стоматологической практиках с возможностью определения индивидуальных характеристик, так и в клинике – диагностика патологических процессов и контроль качества лечения пациентов с патологией соединительной ткани. Вопрос об использовании АСМ для исследования особенностей костной ткани и твердых тканей зубов при различного рода диспластических процессах типа синдрома Педжетта, синдрома Марфана, синдрома Элерса-Данло и т.д. заслуживает дальнейшего изучения.

Литература:

1. Gao HJ, Ji BH, Jager IL, Arzt E, Fratzl P. Materials become insensitive to flaws at nanoscale: lessons from nature. PNAS 2003; 100:5597– 600.

2. Roschger P, Gupta HS, Berzanovich A, Ittner G, Dempster DW, Fratzl P, et al. Constant mineralization density distribution in cancellous human bone. Bone 2003;32:316– 23.

3. Cadet ER, Gafni RI, McCarthy EF, McCray DR, Bacher JD, Barnes KM, et al. Mechanisms responsible for longitudinal growth of the cortex: coalescence of trabecular bone into cortical bone. J Bone Jt Surg, Am Vol 2003;85A:1739– 48.

4. Rubin MA, Jasiuk L, Taylor J, Rubin J, Ganey T, Apkarian RP. TEM analysis of the nanostructure of normal and osteoporotic human trabecular bone. Bone 2003;33(3):270– 82.

5. Gutsmann T, Fantner GE, Venturoni M, Ekani-Nkodo A, Thompson JB, Kindt JH, et al. Evidence that collagen fibrils in tendons are inhomogeneously structured in a tubelike manner. Biophys J 2003; 84:2593– 8.

6. Venturoni M, Gutsmann T, Fantner GE, Kindt JH, Hansma PK. Investigations into the polymorphism of rat tail tendon fibrils using atomic force microscopy. Biochem Biophys Res Commun 2003; 303:508– 13.

7. Ng L, Grodzinsky AJ, Patwari P, Sandy J, Plaas A, Ortiz C. Individual cartilage aggrecan macromolecules and their constituent glycosaminoglycans visualized via atomic force microscopy. J Struct Biol 2003;143:242– 57.

8. Katz EP, Li S. Structure and function of collagen fibrils. J Mol Biol 1973;80:1– 15.

9. Tong W, Glimcher MJ, Katz JL, Kuhn L, Eppell SJ. Size and shape of mineralites in young bovine bone measured by atomic force microscopy. Calcif Tissue Int 2003;75:592– 8.

10. Lees S. Mineralization of type I collagen. Biophys J 2003;85:204– 7.

11. Chiego D.J. The early distribution and possible role of nerves during odontogenesis. Int. J.Develop.Biol., 1995, v.39, №1, p. 191 – 194.