Биологические науки / 6. Микробиология

К.б.н. Скроцкая О.И.

Национальный университет пищевых технологий, Украина

Современные методы повышения эффективности процессов получения бутанола с помощью бактерий рода Clostridium

Использование микроорганизмов для промышленного производства органических соединений является достаточно актуальной задачей нынешнего времени, а с помощью методов метаболической инженерии можно значительно улучшить процесс микробиологического получения разнообразных веществ. Кроме классических технологий в настоящее время все чаще используют технологии рекомбинантных ДНК, вводя в прокариотическую клетке новые гены или модифицируя существующие, что позволяет направлено влиять на метаболизм микроорганизмов.

Бактерии рода Clostridium способны продуцировать бутанол в процессе ацетоно-бутилового брожения, при наличии соответствующего субстрата и оптимальных условий для самого процесса брожения. Исследования метаболизма этих бактерий с целью создания штаммов с высокой производительностью выхода бутанола были начаты с начала возникновения генной инженерии и продолжаются до этого времени учеными многих стран мира.

Основными заданиями метаболической инженерии бактерий рода Clostridium являются: высокая производительность образования бутанола, повышения толерантности к бутанолу и расширенный диапазон использования субстратов.

Клостридии – облигатные анаэробы. Однако спектр их чувствительности к молекулярному кислороду достаточно широкий, что связано с выявлением у бактерий рода Clostridium супероксиддисмутази, которая принимает участие в процессе нейтрализации токсичниго влияния О₂ и его производных. Выявленные разные виды клостридий – от строго анаэробных видов (C. pasteurianum, C. kluyveri) к почти аэротолерантным (C. histolyticum, C. acetobutylicum).

Исследования относительно увеличения аэротолерантности бактерий рода Clostridium показали, что удаление гена пероксидазного репрессора (PerR) C. acetobutylicum приводит к длительной аэротолерантности бактерий, не ограничивает их рост в аэробных условиях и повышает стойкость микроорганизмов к H₂O₂ [2]. Практическое использование полученных результатов может значительно упростить аппаратурное оформление процесса ацетоно-бутилового брожения и увеличить производительность выхода бутанола.

Проводятся работы относительно расширения диапазона потребления субстратов бактериями рода Clostridium. В частности в качестве потенциального субстрата исследуется целлюлоза. Для потребления бактериями целлюлозы необходимое наличие ферментов, которые отвечают за ее расщепление. Существует несколько сиквенорованных микроорганизмов, которые содержат полный функциональный целюлазный комплекс, к тому же известны целюлолитические клостридии (C. phytofermentans, C. thermocellum, C. cellulolyticum), которые продуцируют ацетат, лактат, и этанол как первичные метаболиты. Ряд работ показывает, что бактерии рода Clostridium могут усваивать целлюлозу без каких-либо генетических модификаций, но несмотря на то, что указанные бактерии содержат полный комплекс генов целюлазных ферментов, они не способны к полному расписанию целлюлозы. Причиной этого является или наличие гена, который препятствует функционированию целлюлаз или существенная мутация в структуре фермента, или неспособность к перенесению и активации целюлосомы в правильном клеточном месте [3, 4].

Метаболизм бактерий C. acetobutylicum двухфазный; при периодическом культивировании сначала образуются кислоты – ацетат и бутират, а позже нейтральные продукты – бутанол, ацетон, и этанол. В процессе ацетоно-бутилового брожения образование кислот снижает pH среды, в дальнейшем образованные кислоты превращаются в растворители. Процесс образования растворителей связан с образованием спор C. acetobutylicum [5]. В промышленном отношении образования растворителей неспорообразуючими штаммами являются желательным, потому что бактерии рода Clostridium синтезируют растворители только в течение узкого промежутка времени – к началу процесса спорообразования. Поэтому, способность уменьшить спорообразование без уменьшения количества синтезированных растворителей увеличила бы специфическую клеточную производительность при непрерывном или полунепрерывном процессах брожения и улучшила бы экономику процесса. Существуют разные подходы для решения этой проблемы, одним из которых есть введения генов, которые отвечают за синтез растворителей в бактериальную ДНК неспорообразующего и неспособного к продуцированию бутанола штамма C. acetobutylicum.

Резистентность к продуктам метаболизма является одной из наиболее исследуемых проблем, которые связаны с микробиологическим производством бутанола. Известно, что бутанол делает невозможным потребление глюкозы, поэтому не происходит образования энергии в клетке и наблюдается внутриклеточное падение активности АТФ-ази. Допускается, что изменения, какие связанные с процессом споруляции, влияют на толерантность бактерий к бутанолу. Действительно, экспрессия главного регулятора процесса споруляции (Spo0A) приводила к росту стойкости клеток к бутанолу и продлевала метаболизм бактерий при его наличии [6]. Возможно, введение нескольких генов, которые отвечают за толерантность бактерий к высоким концентрациям растворителей в бактериальную ДНК, приведет к созданию стойкого к высоким концентрациям бутанола штамма C. acetobutylicum.

Учитывая выше сказанное, можно допустить, что в будущем будет созданный штамм бактерий рода Clostridium, который будет характеризоваться способностью к синтезу большого количества бутанола, отсутствием спорообразования, аэротолерантностью, высокой производительностью и простотой ведения биопроцесса.

Литература:

1. Ezeji T.C., Qureshi N., Blaschek H.P. Bioproduction of butanol from biomass: from genes to bioreactors // Current Opinion in Biotechnology. – 2007. – Vol. 18. – P. 220–227.

2. Hillmann F., Fischer R.J., Saint-Prix F., Girbal L., Bahl H. PerR acts as a switch for oxygen tolerance in the strict anaerobe Clostridium acetobutylicum // Molecular Microbiology. – 2008. – Vol. 68. – P. 848–860.

3. Berezina O.V., Sineoky S.P., Velikodvorskaya G.A., Schwarz W., Zverlov V.V. Extracellular glycosyl hydrolase activity of the Clostridium strains producing acetone, butanol, and ethanol // Applied Biochemistry and Microbiology. – 2008. – Vol. 44. – P. 42–47.

4. Lopez-Contreras A.M., Gabor K., Martens A.A., Renckens B.A., Claassen P.A., Van Der Oost J., De Vos W.M. Substrate-induced production and secretion of cellulases by Clostridium acetobutylicum // Applied and Environmental Microbiology. – 2004. – Vol. 70. – P. 5238–5243.

5. Durre P. Biobutanol: an attractive biofuel // Journal of Biotechnology. – 2007. – Vol. 2. – P. 1525–1534.

6. Alsaker K.V., Spitzer T.R., Papoutsakis E.T. Transcriptional analysis of spo0A overexpression in Clostridium acetobutylicum and its effect on the cell’s response to butanol stress // Journal of Bacteriology. – 2004. – Vol. 186. – P. 1959–1971.