д.м.н. Кручинина М.В., к.м.н. Громов А.А., Баум В.А., Рабко А.В.

ФГБУ «НИИ  терапии» СО РАМН, Новосибирск, Россия

к.х.н. Кручинин В.Н., к.т.н. Рыхлицкий С.В., к.ф.-м.н. Володин В.А.

Институт физики полупроводников им. А.В. Ржанова СО РАН, Новосибирск

д.ф.-м.н. Князев Б.А., Герасимов В.В.

Институт ядерной физики им. Г. И. Будкера СО РАН, Новосибирск, Россия

Новосибирский государственный университет, Новосибирск, Россия

к.ф.-м.н. Анцыгин В.Д.

Институт автоматики и электрометрии СО РАН, Новосибирск, Россия

 

Особенности параметров эритроцитов, гемостаза при цереброваскулярной патологии – новые возможности оптических методов

 

Введение. В последние годы интенсивно разрабатывается учение о роли систем гемореологии и гемостаза в развитии ишемических нарушений мозгового кровообращения. Принципиальное значение имеет разработка концепции гетерогенности ишемического инсульта, которая обозначила исключительное многообразие его причин и механизмов, определяющих чрезвычайный полиморфизм структурных поражений головного мозга и клинических проявлений [1]. В связи с этим особую актуальность имеет разработка новых подходов в диагностике наблюдаемых нарушений, причем на ранних стадиях. Оптические методы занимают особое место в биомедицинских исследованиях, благодаря высокой чувствительности, неразрушающему и невозмущающему характеру воздействия на исследуемый объект [2]. Кроме того, известно, что цереброваскулярная патология сопровождается не только изменениями гемореологического статуса, но и выраженными сдвигами в составе и структуре компонентов сыворотки крови, что, в свою очередь, приводит к изменению ее оптических характеристик [3].

Цель. Оценить возможности оптических методов исследования сыворотки крови, эритроцитов у пациентов с цереброваскулярной патологией для использования их в диагностике.

Материалы и методы. Обследованы: 10 мужчин (45-67 лет) без признаков цереброваскулярной патологии и заболеваний внутренних органов (группа сравнения) и 12 мужчин (43-70 лет), перенесших ишемический инсульт (на фоне артериальной гипертензии II-III ст., дислипидемий IIa, IIb типа), преимущественно в подостром и резидуальном периодах. У обследуемых проведены исследования: системы гемостаза - стандартными методами, электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов - методом диэлектрофореза в частотном диапазоне 5.104-106Гц, взвесей эритроцитов -методом терагерцовой спектроскопии; тонких пленок, полученных из сыворотки крови центрифугированием, - методом спектральной эллипсометрии и спектроскопии комбинационного рассеяния света (Raman).

Результаты исследования.

При сравнении наблюдаемых групп выявлены достоверные различия в параметрах эритроцитов: у больных, перенесших инсульт, обобщенные показатели жесткости, вязкости, электропроводности мембран эритроцитов, относительной поляризуемости, индексов агрегации, деструкции достоверно выше, а среднего диаметра клетки, поляризуемости на всех частотах, емкости мембран клеток, скорости движения к электродам, дипольного момента, амплитуды деформации эритроцитов под действием неоднородного переменного электрического поля (НПЭП) - ниже по сравнению с группой контроля (p<0,0001-0,05). У больных, перенесших инсульт, обнаружено достоверное увеличение скорости лейкоцитарно-тромбоцитарной агрегации (ЛТА) по сравнению с аналогичными показателями здоровых лиц (7,92+0,07 против 11,5+0,3 с, р<0,001), выявлена обратная корреляция этого показателя со сроками инсульта (r=-0,45, p<0,05). Агрегация тромбоцитов (ГАТ 10-2) оказалась достоверно ниже по сравнению с группой контроля (16,2+0,3 против 13,4+0,4 с, р<0,01), снижение скорости агрегации тромбоцитов при инсульте, вероятно, обусловлено потреблением активных клеток в кровотоке [4]. О повреждении эндотелия свидетельствует повышение уровня фактора Виллебранда в плазме крови больных инсультом (128,6+11,7 против 92,2+7,4 %, р<0,05) [5].

Исследование взвесей эритроцитов методом терагерцовой спектроскопии выявило  низкие уровни амплитудного пропускания излучения на всех частотах диапазона у пациентов с цереброваскулярной патологией в отличие от группы контроля (p<0,001-0,05) (см. рис. 1). Причем, спектроскопические показатели коррелировали со склонностью эритроцитов к образованию агрегатов (r=0,61, p<0,01), преобладанием деформированных форм эритроцитов  (r=0,74, p<0,05), сниженным дипольным моментом клеток (r=-0,52, p<0,03), амплитудой деформации эритроцитов под действием НПЭП (r=-0,43, p<0,02) и емкостью мембран эритроцитов (r=0,45, p<0,05).

Рис. 1. Зависимость амплитуды пропускания ТГц излучения слоями взвесей эритроцитов пациентов, перенесших инсульт (1) и лиц группы контроля (2).

 

Исследование эллипсометрических показателей тонких пленок, полученных из сывороток крови пациентов с инсультами, выявило достоверное снижение показателя преломления (1,48+0,003 против 1,52+0,004, p<0,0001) в сочетании с увеличением толщины пленки (175,4+3,4 против 159,3+2,7, p<0,001), степенью ее неоднородности (3,48+0,9 против 1,4+0,7 p<0,05) по сравнению с группой контроля. Толщина пленки оказалась зависящей не только от ряда биохимических параметров (уровня общего холестерина r=0,62, p<0,002; триглицеридов r=0,53, p<0,03; общего белка r=0,44, p<0,03), но и от факторов свертывания крови (ГАТ 106 - r=0,749, p<0,033; ЛТА - r=0,758, p<0,029; уровня фибриногена r=0,61, p<0,02). В то же время на равномерность пленок также оказывали влияние факторы гемостаза (ЛТА физиологическая - r=0,792, p<0,019; уровень аутокоагуляционного теста, А2 - r=-0,729, p<0,05; антитромбина III - r=-0,852, p<0,007). Показатель преломления в большей степени зависел от уровня трансаминаз, показателей пуринового обмена.

При исследовании жидких сывороток крови пациентов, перенесших инсульты, и лиц группы сравнения существенные изменения наблюдались и в спектрах комбинационного рассеяния света, где регистрируются интенсивности пиков, связанных с колебаниями отдельных молекулярных фрагментов, определяющих вторичную структуру белков.

Рис.2 Спектры комбинационного рассеяния света жидких сывороток крови пациентов, перенесших инсульт (1) и лиц группы контроля (2).

 

В спектрах комбинационного рассеяния света образцов жидких сывороток крови в области 750-1750 см-1 наблюдается ряд характерных пиков поглощения при 780, 860 см-1, интенсивности которых оказались достоверно ниже, а при 1001, 1154, 1210, 1391 и 1518 см-1 - достоверно выше у пациентов с цереброваскулярной патологией по сравнению с контролем (р<0,001-0,05).

При детальном анализе выяснилось, что величины интенсивности пиков в Раман-спектрах зависели как от биохимических параметров сыворотки крови, так и от показателей системы гемостаза. Соответственно, выявились корреляции и с данными эллипсометрии тонких пленок из сывороток крови. Поскольку между компонентами сыворотки крови и мембранами эритроцитов происходит постоянный обмен составляющими [6], то неудивительными оказались и связи пиков Раман-спектров с вязкоупругими параметрами эритроцитов.

Площади пиков при 780, 860 см-1 оказались связанными с биохимическими показателями функции печени – уровнем общего (r=0,775, p<0,041 для 860 см-1)  и прямого билирубина (r=0,847, p<0,016 для 860 см-1), АСТ (r=-0,897, p<0,006 для 780 см-1), ЩФ (r=-0,875, p<0,01 для 780 см-1), а также – с уровнем мочевой кислоты (r=-0,786, p<0,036 для 780 см-1). Кроме того, на интенсивность данных пиков оказывали влияние факторы гемостаза – уровень антитромбина III (r=-0,731, p<0,04 для 780 см-1; r=0,85, p<0,007 для 860 см-1), протеина С (r=-0,779, p<0,05 для 780 см-1; r=0,934, p<0,006 для 860 см-1), волчаночного антикоагулянта (r=-0,767, p<0,026 для 860 см-1). По данным Downes A., Elfick A. [7] на интенсивность пика при 780 см-1 оказывали влияние уровень ДНК, выраженность колебаний групп О-Р-О протеинов; в отношении же пика при 860 см-1 значимым оказался уровень аминокислоты тирозин [8, 9]. С ней связывают стресс-протекторную, психостимулирующую, регулирующую функции щитовидной железы и надпочечников, она является предшественником нейромедиаторов. Снижение интенсивности пика при 860 см-1 у пациентов с инсультами в определенной степени отражает снижение уровня данной аминокислоты, ряда протеинов, чем, вероятно, определяются нарушения ряда когнитивных функций при цереброваскулярной патологии.

Показатель преломления тонких пленок, полученных из исследуемых сывороток, прямо и с высокой силой коррелировал с высотой пика при 860 см-1  (r=0,714, p<0,0001) и обратно был связан со степенью однородности полученных пленок (r=-0,643, p<0,05). Толщина пленок при этом обратно зависела от высоты пика при 780 см-1  (r=-0,196, p<0,042). Выявлено, что высота пика при 780 см-1 оказалась связанной с уровнем гемолиза эритроцитов на низких частотах (r=-0,717, p<0,045), вместе с тем, она оказывала влияние на положение равновесной частоты (r=0,683, p<0,05). Степень же деформации эритроцитов на частоте 0,5 МГц прямо и с высокой силой коррелировала с площадью пика при 860 см-1 (r=0,755, p<0,031).

Интенсивности пиков при 1001, 1154, 1210, 1391 и 1518 см-1 оказались в большей степени связанными с показателями липидного спектра сыворотки крови, измененного пуринового обмена, нарушенной функцией почек. Это согласуется с результатами исследования Tatarkovic M. еt al. [8] о влиянии на выраженность данных пиков уровней липидов атеросклеротических бляшек, каратиноидов [9]. Так, площадь пика при 1001 см-1 прямо коррелировала с уровнем холестерина ЛПНП (r=0,971, p<0,001), мочевой кислоты (r=0,865, p<0,012) и обратно – с уровнем ХС ЛПВП (r=-0,908, p<0,005). По данным Rodia-Osornio L.N. et al. [9]  на интенсивность данного пика оказывает существенное влияние дисбаланс фениналанина. Известно, что избыточное накопление этой незаменимой аминокислоты и ее метаболитов оказывает неблагоприятное воздействие на нервную систему. Площадь пика при 1210 см-1  продемонстрировала связь с уровнем креатинина (r=0,811, p<0,027), отклонение пика при 1391 см-1 оказалось зависящим от уровня общего холестерина (r=-0,841, p<0,036), а его высота – от уровня триглицеридов (r=0,771, p<0,05). Интересными оказались связи вышеуказанных пиков с показателями гемостаза. Уровни протромбинового индекса, растворимых комплексов фибрин-мономера прямо коррелировали с площадью пика при 1391 см-1 (r=0,75, p<0,05; r=0,777, p<0,04, соответственно). Уровень антитромбина III оказывал влияние на высоту пика при 1154 см-1(r=0,778, p<0,023), а уровни протеина С и волчаночного антикоагулянта влияли на площадь пика при 1518 см-1 (r=0,943, p<0,005; r=0,707, p<0,05, соответственно). Возможно, полученные результаты объясняются данными Rodia-Osornio L.N. et al. [9],  Camerlingo C. Et al. [10], которые установили зависимость интенсивности пиков при 1154, 1518 см-1 от количества С-С связей, выраженности деформационных колебаний С-ОН, уровней amid I молекул протеинов.

Из эллипсометрических показателей выявились обратные взаимосвязи показателя преломления с площадью пика при 1154 см-1 (r=-0,642, p<0,05) и прямые – с толщиной пленки (r=0,747, p<0,0001). С неоднородностью пленок коррелировало отклонение пика при 1210 см-1 (r=0,69, p<0,05). Обнаружены связи ряда вязкоупругих показателей эритроцитов с интенсивностями пиков Раман-спектров. Так, амплитуда деформации клеток оказалась обратно связанной с интенсивностью пика при 1001 см-1 (r=-0,722, p<0,043), а обобщенная жесткость эритроцитов продемонстрировала с ней прямую связь (r=0,766, p<0,027). Обобщенная вязкость коррелировала с интенсивностями пиков при 1001 см-1 (r=0,922, p<0,001) и при 1210 см-1 (r=0,85, p<0,007). Уровень гемолиза на высоких частотах был связан с интенсивностью пика 1518 см-1 (r=0,807, p<0,015 для 1 МГц; r=0,818, p<0,013 для 0,5 МГц).  

Таким образом, выявленные новые возможности оптических методов исследования крови, ее отдельных компонентов являются весьма перспективными в диагностике цереброваскулярной патологии, гетерогенности ишемического инсульта, возможно, в будущем, и на ранних стадиях. Они проливают свет на взаимосвязи, взаимозависимости компонентов гемореологии между собой при развитии острых нарушений мозгового кровообращения.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Минобрнауки РФ (ГК №02.740.11.0556), гранта РФФИ 11-02-12171-офи-м при использовании оборудования ЦКП СЦСТИ в рамках ГК № 16.552.11.7044 и при использовании оборудования научно-образовательного комплекса НГУ «Наносистемы и современные материалы».

 

 

 

 

Литература:

1.           Суслина З.А., Танашян М.М., Ионова В.Г. Ишемический инсульт: кровь, сосудистая стенка, антитромботическая терапия. - М.: Медицинская книга. - 2005. - 248 с.

2.           Arwin H. Ellipsometry on thin organic layers of biological interest: characterization and applications // Thin Solid Films. - 2000. - V.377-378. - P.48-56.

3.           Nogueira G.V., L. Silveira, A., Jr., Martin A. et al. Raman spectroscopy study of atherosclerosis in human carotid artery // J. of Biomed. Optics. – 2005. - V.10. - No.3. - P.031117(1-7).

4.           Coull B., Williams L., Goldstein L. et al. Anticoagulants and antiplatelet agents in acute ischemic stroke // Stroke. – 2002. – V.33. – No.7. – P.1934-1942.

5.           Drexler H., Hornig B. Endothelial dysfunction in human disease // J. of molecular and cellular cardiology. – 1999. – V.31. – No.1. – P.51-60.

6.           Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А. Физиология и патофизиология эритроцита. - Томск: Из-во ТГУ. - 2004. - 202 с.

7.           Downes A., Elfick A. Raman spectroscopy and related techniques in biomedicine // Sensors. – 2010. – N.10. – P.1871-1889.

8.           Tatarkovic M., Fisar Z., Raboch J., Jirak R., Setnicka V. Can chiroptical spectroscopy be used for the analysis of blood plasma? // Chirality. – 2012. – V.6. – P.459-467.

9.           Rocha-Osornio L.N., Pichardo-Molina J.L., Barbosa-Garcia O. et al. Chemamometric techniques on the analysis of Raman spectra of serum blood samples of breast cancer patients // Proc. of SPIE. – 2008. – V.6864. – P.16(1-7).

10.       Camerlingo C., Zenone F., Perna G. et al. An investigation on micro-raman spectra and wavelet data analysis for pemphigus vulgaris follow-up monitoring // Sensors. – 2008. – V.8. – P.3656-3664.