Экология/6. Экологический мониторинг

К.б.н. Мынбаева Б.Н., д.б.н. Саданов А.К., д.б.н. Курманбаев А.А.

Казахский национальный педагогический университет, Центр биологических исследований, институт микробиологии и вирусологии, Казахстан

Использование культуры Azotobacter  в биодиагностике городских почв

Охрана почв от возрастающего техногенного влияния, в частности от загрязнения тяжелыми металлами (ТМ), относится к актуальным проблемам взаимодействия общества и природы. Попадая в почву, ионы ТМ приводят к изменениям физико-химических свойств почв, а также влияют на почвенный микробоценоз. Бактерии рода Azotobacter традиционно используются как индикаторы химического загрязнения почвы.

Целью данной работы являлось изучение возможности применения микробного теста Azotobacter для оценки состояния почв г. Алматы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объектом исследований выбраны образцы почв г. Алматы, отобранные в следующих участках (или точках): т. № 1 - проспект им. Райымбека (пересечение с ул. им. Пушкина); т. № 2 - проспект им. Райымбека (пересечение с пр. им. Сейфуллина); т. № 3 - проспект им. Райымбека (пересечение с ул. им. Розыбакиева); т. № 4 - район ТЭЦ-1; т. № 5 - 25 км от города (фон или контроль). Образцы почв отбирали согласно общепринятой методике отбора проб для проведения почвенного мониторинга [1]. Для микробиологических исследований отбор проб производился с соблюдением стерильных условий. рН почвы определяли с помощью прибора pHметр–150M. Обилие азотфиксирующих бактерий рода Azotobacter учитывали методом комочков обрастания на агаризованной безазотной среде Эшби [2]. Индекс токсичности рассчитывали по [3]. Подготовку проб для определения ТМ (Pb, Cd, Cu и Zn) проводили по методике [4], а их содержание - на атомно-абсорбционном спектрометре с электротермической атомизацией АА-6650 фирмы «Shumadzu» [5].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.1  Определение содержания TM в почвах г. Алматы

В городских почвах накапливаются разнообразные соединения естественного и антропогенного происхождения, обуславливающие загрязненность урбаноземов. Основные загрязнители почв - ТМ, присутствие которых связано с токсичностью почв, а их количество – со степенью токсичности. В г. Алматы перекрестки с интенсивным транспортным движением имели полиметаллическое (Cd, Pb, Cu, Zn) загрязнение, но их содержание варьировало от места отбора (таблица 1). Содержание Cd во всех опытных образцах превышало контроль (максимальное превышение составило примерно 4,2 раза в т. № 3). В этой же точке отбора почвы имели повышенное содержание Cu (превышение по сравнению с контролем составило 2,5 раза); превышение по Pb и Zn составило 2,6 и 1,5 соответственно. Таким образом, почвенные образцы из т. № 3, (позже выявленные как токсичные по результатам экспериментов с биотестовой культурой Azotobacter), содержали наибольшее количество TM (кроме Pb). Т. № 4 имела максимальное превышение дозы Pb по сравнению с контролем в 3,2 раза, содержание остальных TM было также значительным и превышение составило: Cd - 2,6, Cu - 2,0, Zn - 1,5 раза.

Таблица 1 – Содержание тяжелых металлов в почвенных образцах

Точкa отбора почвенных проб

Концентрация кислоторастворимых форм

TM, мг/кг

Cd

Pb

Cu

Zn

№ 1

0,51±0,012

44,8±0,265

36,4±0,265

59,6±0,153

№ 2

0,39±0,015

42,1±0,436

43,7±0,208

59,2±0,208

№ 3

0,67±0,015

50,5±0,306

52,7±0,252

59,7±0,231

№ 4

0,41±0,015

63,8±0,153

42,8±0,306

60,7±0,208

№ 5

0,16±0,015

19,8±0,208

21,5±0,265

41,3±0,351

Для оценки степени химического загрязнения почв был использован коэффициент опасности (Ко), который показывал во сколько раз содержание элемента-экополлютанта в почвенной пробе выше его ПДК. Наибольшие значения Ко отмечены для Pb от 1,3 до 2,0, Cd - около 1,3 и Cu - от 1,0 до 1,6 (гистограмма 1).

Гистограмма 1 - Превышение концентрации кислоторастворимых форм ТМ по сравнению с ПДК (%) в образцах почв г. Алматы

1.2. Экология культуры Azotobacter при исследовании почвенных образцов, загрязненных ТМ

Клетки бактериальной культуры Azotobacter были выделены в большом количестве из почвенных образцов степной зоны (25 км от города) и в некоторых нейтральных и слабощелочных почвах г. Алматы. В настоящем исследовании интегральный показатель биологического состояния почвы был рассчитан по следующим параметрам (таблицa 2): обилие бактерий рода Azotobacter, средний диаметр их колоний и индекс токсичности (ИТ). Наибольший ИТ имели пробы почв,  взятых на интенсивном транспортном перекрестке (т. № 3), число колоний Azotobacter и средний диаметр колоний в них минимальные, т.о. эта почва отнесена к токсичным. Почвенный образец возле ТЭЦ-1 находился на 2 месте по токсичности (т. № 4). Показатели токсичности, количество колоний Azotobacter и их диаметр из т. № 1 и т. № 2 были близки между собой и соответствовали категории «среднетоксичных» почв. В контрольном варианте (степная зона за городом) все 3 показателя свидетельствовали о благополучии в  почвенных образцах.

Таблица 2 – Некоторые параметры роста и развития культуры Azotobacter в анализируемых почвенных образцах

Точка отбора почвенных проб

Средний диаметр колоний Azotobacter, (см)

Среднее число колоний Azotobacter в 1 г почвы

ИТ

№ 1

0,61±0,07

124,1±5,2

0,70

среднетоксичная

№ 2

0,57±0,04

120,8±7,8

0,67

среднетоксичная

№ 3

0,39±0,05

84,6±8,5

0,46

токсичная почва

№ 4

0,46±0,03

102,5±10,6

0,55

близкая к токсичной

№ 5

0,73±0,05

157,5±14,3

почва стимулирующая

 

Таким образом, у азотфиксирующей культуры Azotobacter наблюдались различия в скорости роста, количестве колоний и их диаметре; выявлена зависимость между показателями роста и развития данной тест-культуры и содержанием ТМ в почвенных образцах.

1.3. Зависимость количества Azotobacter от концентрации ТМ в почвенных образцах

В урбаноземах, загрязненных ТМ, через месяц наблюдали значительное снижение численности бактерий Azotobacter. По степени токсичности Cd явился самым токсичным металлом из исследуемых, т.к. ингибирующее действие ТМ на Azotobacter проявилось весьма значительно в почвенных образцах, взятых в т. № 3 (наибольшее содержание Cd = 0,67 мг/кг) и т. № 4 (наибольшее содержание Pb = 63,8 мг/кг) (гистограмма 2).

Гистограмма 2 - Изменение численности Azotobacter (в %) при ингибирующем воздействии TM

Таким образом, рост колоний Azotobacter на среде Эшби составил – 53,7%  из почвенных образцов в т. № 3 и 65,1% из образцов почвы, взятых в т. № 4, очевидна коррелятивная связь между высокими концентрациями Cd и Pb в этих пробах и количеством колоний Azotobacter (почти на 40-50 % меньше, чем в почвенных пробах за городом). В т. № 1 и т. № 2 (среднее значение загрязнений почв по Pb) выявлено около 25% уменьшения числа колоний азотобактер. Содержание Cu и Zn также оказало определенное ингибирующее воздействие на микробиоту почв по сравнению с контролем.

1.4 Морфология культуры Azotobacter

    На плотных питательных средах клетки культуры образовывали плоские, слизистые колонии пастообразной консистенции диаметром 5-10 мм, в жидких питательных средах - плёнки. Культура Azotobacter явилась мезофильной и росла при температуре 20-30°C, для нее характерна бесцветная слизистая оболочка (таблица 3).

Таблица 3 - Морфология колоний Azotobacter (фото 1 б)

Морфология колоний Azotobacter, инкубированных на твердой питательной среде (свободной от азота) при 30° С в течение 4 дней

размер

1-5 мм диаметр

форма

круглая

пигментация

сливочно- бежевая белизна

поднятие

приподнятые колонии

край

гладкий

поверхность

гладкая

под отраженным светом

опалесциирующий, сияющий

структура

аморфная

консистенция

клейкая

аромат

мускусный

другие характеристики

большие области округлых колоний, которые напоминают одну большую колонию

другие колонии

не было никаких других видимых типов колоний

 

В дальнейших исследованиях были изучены морфологические признаки культуры Azotobacter (фото 1).

C:\Users\User\Desktop\Рита\Рита фото пейзаж\2-1_15.05.09г\2-1(10).jpg               

                                а                                                                    б

Фото 1 – Культура Azotobacter: а - общий вид × 40; б - колонии  Azotobacter вокруг почвенных частиц

На фото 1 а видны палочковидные и кокковидные бактериальные клетки различного размера, окраска по Граму. На микроскопических препаратах клетки бактерий Azotobacter выглядели относительно крупными (1-2 мкм в диаметре), имели чаще палочковидную форму, располагаясь  одиночно, парами, неправильными скоплениями или, изредка, цепочками различной длины. Неспорообразующая культура, формирующая особые покоящиеся формы - цисты. В свежих культурах клетки были подвижны за счёт многочисленных жгутиков. В более поздних культурах клетки теряли подвижность, приобретали почти кокковидную форму и продуцировали толстый слой слизи, формирующий капсулу клетки. При микроскопии в клетках наблюдали определенные включения, часть из которых окрашивается, а часть остаётся бесцветными, считается, что прокрашиваемые гранулы состоят из волютина, неокрашивающиеся же гранулы являются каплями жира [6]. При росте культуры на твердой питательной среде наблюдали образование цист.

1.5. Модельные эксперименты с тест-культурой Azotobacter

В модельных экспериментах в почвенные образцы вносили растворы солей металлов (Pb(CH3COO)2х7Н2О, CuSO4, CdSO4 и ZnSO4) в следующих вариантах: 1. в концентрациях в 2 раза превышавших контрольные; 2. в 5 раз; 3. в 10 раз. Контролем служили естественные урбаноземы, содержавшие определенную концентрацию ТМ (табл. 1). Почвенные модельные образцы, с внесенными растворами TM и контроль, инкубировали в эксикаторах (60% от ПВ, температура 25°С).

Все исследованные показатели роста и развития культуры Azotobacter (количество колоний, их средний диаметр и ИТ) снижали свои значения при загрязнении почвы ТМ в модельном опыте (таблица 4). На основании этих же экспериментов были введены еще 2 экологических показателя, характеризующих зависимость популяции Azotobacter от концентрации ТМ в почвенных образцах: среднесмертельный показатель LD50 и биоцидный показатель LD100 (таблица 4).

Таблица 4 – Экологические характеристики развития культуры Azotobacter в модельном эксперименте

Вариант модельного опыта

Средний диаметр колоний Azotobacter, (см)

ИТ

Среднее число колоний Azotobacter в 1 г почвы

1

0,36±0,05

0,43

78,2±6,3

2

0,16±0,01

0,24

51,7±4,9

3

0,07±0,01

0,11

8,4±1,1

контроль

0,50±0,09

0,60

108,0±9,5

 

Среднесмертельный показатель LD50 наблюдали при концентрациях ТМ, соответствовавших варианту 2 модельного эксперимента. Летальная доза ТМ LD100 для бактерий Azotobacter в данном опыте не выявлена.  

Таким образом, нами подтверждена биоиндикационная функция бактерий Azotobacter, а также возможность использования данной тест-культуры  для диагностики загрязнения урбанизированных почв г. Алматы.

Использованная литература

1.     Общие требования к отбору проб. ГОСТ 17.4.3.01-83 (СГ СЭВ 3347-82). - М. - 1983.

2.     Gulyas F. et al. Analysis of soil Toxicity using Azotobacter by soil disk method /Proc. World Conf. Oct. 25-31, 1987. – Amsterdam. – 1988. – P. 753-755.

3.     Кабиров Р.Р., Хазипова Р.Х. Альгологический метод оценки токсичности ПАВ /Биоиндикация и биомониторинг - М. - Наука. - 1991. - С. 282-285.

4.     Общие требования к отбору проб. ГОСТ 28168-89. - М. - 1989.

5.     Методика выполнения измерения массовой доли  подвижных форм металлов. РД 52.18.269-90. - М. - Госкомитет СССР по «Гидрометеорологии». - 1990.- 35 С.

6.     Lewis I. M. The cytology of bacteria // Bacteriological Reviews. - 1991. -Vol. 5. - No. 3. - P. 181-230.