Біологічні науки/9. Біохімія і біофізика

Сорочак М.В., к.б.н. Копач О.В.

Національний технічний університет «Київський

політехнічний інститут», Фізико-технічний інститут

(ФТІ НТУУ»КПІ») м. Київ, Україна

Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, м. Київ, Україна

Ідентифікація функціонально-активних екстрасинаптичних АМРА рецепторів у нейронах Substantia Gelatinosa спинного мозку щурів.

Спинний мозок характеризується високим рівнем експресії глутаматних рецепторів, які активуються збуджуючим нейротрансміттером глутаматом і відіграють ключову роль для забезпечення збудливої синаптичної передачі. Виділяють 2 основних типи глутаматних рецепторів: іонотропні та метаботропні, кожний з який поділяється на кілька підтипів. Зокрема, іонотропні глутаматні рецептори поділяються на NMDA, AMPA та канатні рецептори. Чільне місце серед іонотропних глутаматних рецепторів займають AMPА рецептори, оскільки вони опосередковують швидку збуджуючу передачу і відіграють вирішальну роль у забезпеченні синаптичної пластичності ЦНС [2].

Функціональні властивості AMPА рецепторів, наприклад, трансмембранна провідність іонів, визначається молекулярною будовою рецептора. АМРА рецептор являє собою тетрамерний канал, який формується з 4 субодиниць: GluR1, GluR2, GluR3 або GluR4. Канал може формуватися з різних комбінацій субодиниць і бути гомомерним (містить 4 одинакові субодиниці) або гетеромерними (сформований з різних субодиниць). Ключовою субодиницею, яка визначає провідність рецептора до іонів кальцію і, відповідно, властивості АМРА-рецептор-опосередкованих струмів, є GluR2 субодиниця . Так, канал сформований з GluR1, GluR3 і/або GluR4 є проникним до Са²⁺ і характеризується високою Са²⁺ провідністю [1]. Навпаки, вбудовування GluR2 субодиниці попереджує Са²⁺ проникність мембрани та призводить до випрямлення АМРА-рецептор-опосередкованих струмів [1].

Показано, що усі чотири субодиниці AMPА рецепторів експресуються у дорзальному розі спинного мозку, тим не менше, найвищий рівень експресії виявлено для GluR2 субодиниці. GluR1 and GluR2/3 субодиниці глутаматних AMPA рецепторів пов’язані з конкретними типами нейронів у Ламінах I-III дорзального рогу спинного мозку щурів. Таким чином, за нормальних умов у нейронах дорзального рогу експресується переважно Са²⁺-непроникні АМРА рецептори.

Іншою характерною особливістю АМРА рецепторів є їх здатність до переміщення. Дослідження in vivo та in vitro свідчать про те, що АМРА рецептори є дуже мобільними[3-4]. Вони здатні як вбудовуватися у плазматичну мембрану шляхом екзоцитозу, так і інтерналізовуватися у внутрішньоклітинний простір за допомогою ендоцитозу (Petrini et al., 2009). Крім того, субодиниці АМРА рецепторів можуть переміщуватися вздовж плазматичної мембрани шляхом латеральної дифузії [4]. Таке їх переміщення відіграє ключову роль для «настроювання» кількості рецепторів у постсинаптичній мембрані і загалом визначає синаптичну пластичність.

Попередніми роботами нашої лабораторії та інших дослідників було показано, що периферійне запалення викликає суттєві зміни у функціонуванні АМРА рецепторів, локалізованих у синапсах між сенсорними нейронами спинного мозку та периферійними волокнами. Зокрема, периферійне запалення індукує інтерналізацію GluR2 субодиниць АМРА рецепторів із синаптичної мембрани. Беручи до уваги факт постійного переміщення АМРА рецепторів вздовж плазматичної мембрани, цікавим є порівняти функціонування АМРА рецепторів у екстрасинаптичних мембранах. Проте такі дослідження досі не проводили.

Метою даної роботи було дослідити функціонування АМРА рецепторів у екстрасинаптичних мембранах сенсорних нейронів спинного мозку щурів при фізіологічних станах та оцінка їх функціонування за умов патології. Цей напрямок досліджень є важливим для розуміння механізмів розвитку та підтримання периферійного болю та пошуку нових фармакологічних засобів для боротьби з ним.

Матеріали і методи

У самців щурів 20-денного віку викликали периферійне запалення задньої кінцівки шляхом підшкірного введення 100 мкл СFA (Complete Freund’s adjuvant), розведеного 1:1 з 0,9% NaCl. Контрольна група щурів отримувала ін’єкцію 0,9% NaCl.

Після глибокої анестезії тварини, проводили операцію розкриття оболонок спинного мозку та видаляли L4-5 сегменти. Безпосередньо після видалення, спинний мозок поміщали в охолоджений розчин. Розчин постійно оксигенували сумішшю 95% O2 і 5% CO2. Зрізи спинного мозку товщиною 300 мкм нарізали за допомогою вібратома. Зрізи зберігали при кімнатній температурі у фізіологічному бікарбонатному розчині Кребса, який містив у (мМ): 125 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH₂PO4, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 10 глюкози (pH 7.4, осмолярність 310–320 мOсM).

Для ізолювання струмів, опосередкованих активацією АМРА-рецепторів, реєстрацію проводили у розчині, що містив D-APV (50 мкM), бікікулін (5 мкM) та стрихнін (2 мкM) з метою заблокувати NMDA, GABA та гліцинові рецепторів, відповідно. Щоб заблокувати натрієві та потенціал-керовані кальцієві канали, до розчину додавали відповідно TTX (0.5 мкM) та CdCl₂ (100 мкM). 133 K-глюканат; 5 NaCl; 0.5 MgCl₂; 10 HEPES-Na; 2 MgATP; 0.1 GTP-Na and 0.2 фура-2 (pH 7.2, осмолярність 290 мOсM).

Одночасно вимірювали зміни [Са²⁺]_і за допомогою кальційчутливого барвника фура-2, зміни флуоресценції якого вимірювали на довжині хвилі > 510 нм з використанням збуджуючої хвилі довжиною 380 нм. Зміни флуоресценції реєстрували одночасно у сомі та у дендритах і виражали як співвідношення флуоресценції барвника при 340 та 380 нм, що є прямопропорційно до зміни концентрації [Ca²⁺]_і.

Результати та їх обговорення

За одночасно запису АМРА-індукованого мембранного струму та та пов'язаних з ними [Ca2+]i змін у сомі і дендритах у Ламіні-II нейронів спинного рогу, ми безпосередньо оцінили регуляцію AMPA рецепторів і проникність [Ca2+] при контролі і після 24 год як ввели сольовий чи СFA розчин для викликання запалення. Нейрони в основному розділились на дві групи: тонічні та транзієнтні. Тонічні нейрони були визначені як ті що здатні підтримувати продовження розрядження потенціалу дії протяго 1с деполяризуючого вхідного струму і збільшення частоти розряду зі збільшенням сили струму.

Для активації всіх (соматичних і дендритних) AMPA рецепторів і вивільнення глутамату з пресинаптичних нейронів і глії, яке відбувається під час травм спинного рогу або запалення, ми здійснювали промивання слайсів. Промивання викликало вхідний струм, при фіксованому потенціалі на рівні –60 mV, для тонічних і для транзієнтних нейронів. Цей струм характеризується повільним зростанням фази і десенсибілізації на плато. Ми вважаємо, що це в основному відображає активацію не синаптичних AMPA рецепторів через їх відносну чисельність в порівнянні з синаптичною одиницею у нейронній мембрані.

При CFA - індукованому запаленні значно збільшився АМРА - індукований струм і пов'язана з ними [Ca2+]i зміни перехідних процесів в монотонно тонічній групі нейронів. Амплітуда АМРА – індукованої вхідного струму була збільшена на 125 ± 13% через 24 години після CFA в порівнянні із пост-сольовим розчином. Збільшення АМРА - індукованого струму було пов'язано зі збільшенням амплітуди в соматичних і дендритних [Ca2+]i перехідних процесах. Двадцять чотири години після ін'єкції CFA, амплітуда [Ca2+]i транзієнтних нейронів збільшилася на 92 ± 11% і 96 ± 17% у сомі і дендритах, відповідно.

Ці результати показують, що безпосередньо стійке запалення призводить до помітної функціональної зміни вираження AMPA рецепторів в дендритах і сомі тонічних нейронів Substantia Gelatinosa.

Література

1. Burnashev, N., et al. "Divalent ion permeability of AMPA receptor channels is dominated by the edited form of a single subunit." Neuron 8.1 (1992): 189-98.

2. Malinow, R. and R. C. Malenka. "AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity." Annu.Rev.Neurosci. 25 (2002): 103-26.

3. Borgdorff, A. J. and D. Choquet. "Regulation of AMPA receptor lateral movements." Nature 417.6889 (2002): 649-53.

4. Petrini, E. M., et al. "Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation." Neuron 63.1 (2009): 92-105

5. Guire ES, Oh MC, Soderling TR, Derkach VA. Recruitment of calcium-permeable AMPA receptors during synaptic potentiation is regulated by CaM-kinase I. J Neurosci 2008;28:6000-6009.