Коровашкина А.С., Квач С.В., Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

 

Конструирование рекомбинантной плазмиды, содержащей многокопийный CpG-мотив

 

CpG-мотивы представляют собой особые шестичленные нуклеотидные последовательности, содержащие в центральной своей части CpG-динуклеотид. Такие последовательности в 20 раз чаще встречаются в микробной ДНК, чем в ДНК человека и животных. Кроме того, в отличие от микроорганизмов, цито-зин в CpG-динуклеотидах эукариот метилирован. CpG-мотивы узнаются TLR9-рецепторами иммунокомпетентных клеток (В-клетки, макрофаги, дендритные клетки и др.) и стимулируют неспецифический иммунитет человека и животных против инфекционных патогенов, проявляют противоопухолевые и противоаллергенные свойства, а также обладают адьювантной активностью [1–3]. Для человека наиболее эффективной последовательностью является GTCGTT, а для мышей и кроликов – GACGTT [1].

         В настоящее время используются в основном химически синтезирован-ные олигодезоксинуклеотиды, содержащие CpG-мотивы у которых природная фосфодиэфирная межнуклеотидная связь заменена на фосфоротиоатную, поскольку такая связь более устойчива к действию нуклеаз [4, 5]. Фосфоро-тиоатная модификация углеводного скелета CpG-мотивов повышает их способность стимулировать В-лимфоциты, однако при этом, снижает эффективность стимуляции NK-клеток [6] и усиливает токсичность [7, 8].

Важно, что повторение несколько раз мотива в пределах ОДН повышает его иммуностимулирующую активность [9]. Известны ДНК-вакцины, представляющие собой плазмиды, несущие гены, кодирующие те или иные чужеродные для организма-хозяина белки. В ряде случаев, для усиления иммуногенности в плазмиды встраивают несколько копий CpG-мотивов. Так, в ДНК-вакцины против вируса геморрагической септицемии встроены 2 и 4 копии фрагмента, содержащего 12 мотивов GTCGTT, 5 мотивов GACGTT и 1 мотив AACGTT [10].

Известна плазмида pYES2-90CpG, содержащая 90 различных CpG-мотивов. В частности, она содержит 5 повторов тандема, составленного из 12 мотивов GTCGTT, 5 мотивов GACGTT и 1 мотива AACGTT (в сумме – 90 различных CpG-мотивов). Плазмида нарабатывалась в штамме-реципиенте Escherichia coli-Top10 фирмы Invitrogen для изучения ее влияния на иммунитет рыб и креветок [11].

Целью данной работы явилось конструирование плазмидных ДНК, обогащенных CpG-мотивами, и пригодной для клонирования этих нуклеотидных последовательностей в клетках Escherichia coli. Предполагается, что такие конструкции могут использоваться как адьюванты, а также для иммунотерапии и иммунопрофилактики инфекционных, онкологических и аллергических заболеваний.

Объекты и методы исследования. Для получения ДНК, содержащей CpG-мотивы, химически синтезировали прямую (CpG-F) и обратную (CpG-R) цепи олигодезоксинуклеотидов (ОДН) (жирным выделен участок, содержащий 4 повтора CpG-мотива, италика – сайт узнавания рестриктазы HindIII).

CpG-F: 5′- AGCTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTA-3′

          CpG-R: 5′-AGCTTAACGACAAAACGACAAAACGACAAAACGACGA-3′

Для отжига ОДН реакционную смесь, содержащую CpG-R и CpG-F, прогревали при 95°C, а затем охлаждали до 4°C. Фосфорилирование 5′-концов полученного дуплекса осуществляли с помощью Т4-полинуклеотидкиназы. Самолигирование дуплекса проводили по «липким концам», соответствующим сайтам узнавания рестриктазы HindIII, с помощью T4-лигазы. Продукт лигирования (двухцепочечный полидезоксинуклеотид; dsCpG-полинуклеотид) выделяли с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле и амплифицировали, используя ПЦР. Полученные CpG-полинуклеотиды лигировали с Т-вектором, приготовленным на основе плазмиды pXcmkn12 (Сloning Vector Collection, Япония) путем ее обработки рестриктазой XcmI (New England Biolabs, США) в течение 12 ч при 37ºС.

В результате была сконструирована плазмида pCpG-KH11, обогащенная иммуностимулирующими мотивами GTCGTT. Наличие и размер вставки подтверждали методом рестрикционного анализа. Путем последующей трансформации плазмидой pCpG-KH11 клеток Escherichia coli BLR(DE3) (Novagen, США) был получен рекомбинантный штамм E. сoli pCpG-KH11 – продуцент плазмиды, обогащенной CpG-мотивами.

Клетки E. coli pCpG-KH11 выращивали при 37оС в течение 16 ч на среде следующего состава: триптон – 1,0%; дрожжевой экстракт – 0,5%; глицерин – 0,5%; глюкоза – 0,05%; Na2HPO4 – 0,025 М; KH2PO4 – 0,025 М; NH4Cl – 0,05 М; Na2SO4 – 0,005 М; MgSO4 – 0,002 М; FeCl3 – 50 мкМ; CaCl2 – 20 мкМ; MnCl2 – 10 мкМ; ZnSO4 – 10 мкМ; CoCl2 – 2 мкМ; CuCl2 – 2 мкМ; NiCl2 – 2 мкМ, Na2MoO4 – 2 мкМ; Na2SeO3 – 2 мкМ, H3BO3 – 2 мкМ; ампициллин – 150 мкг/мл; (pH 7,0). Продуктивность штамма в отношении плазмиды pCpG-KH11 определяли после выделения плазмиды из клеток стандартным методом щелочного лизиса.

Результаты и их обсуждение. Одним из наиболее перспективных подходов к практическому использованию CpG-мотивов в иммунологии является встраивание этих нуклеотидных последовательностей в плазмиды с последующим введением таких векторных конструкций в организм человека или животных. В результате выполнения данной работы сконструирован плазмидный вектор pCpG-KH11, обогащенный мотивом GTCGTT, который, по литературным данным, наиболее эффективно стимулирует иммунную систему человека [11]. Схематическое изображение плазмиды pCpG-KH11 представлено на рисунке 1.

Наличие в плазмиде встроенных тандемных повторов CpG-мотивов подтверждено методом рестрикционного анализа. С этой целью плазмидную ДНК инкубировали со смесью рестриктаз NdeI и EcoRI, сайты узнавания которых ограничивают клонированный участок.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рисунок 1 – Схематическое изображение плазмиды pCpG-KH11

 

Полученные в результате рестрикции фрагменты затем обработали рестриктазой HindIII, сайты рестрикции которой находятся внутри клонированного участка. Анализ продуктов рестрикции проводили путем электрофореза в 1%-ном агарозном геле (рисунок 2).

 

 

 

 

 

 

 


Рисунок 2 – Электрофоретический анализ рестриктов плазмиды рCpG-KH11

 

1 – фрагменты ДНК c известным количеством пар нуклеотидов;

2 – очищенная плазмида рCpG-KH11;

3 – фрагменты ДНК, полученные после обработки рCpG-KH11 смесью рестриктаз NdeI и EcoRI;

4 – фрагменты ДНК, полученные после обработки рCpG-KH11 смесью рестриктаз NdeI, EcoRI и HindIII.

 

Число клонированных в плазмиде рCpG-KH11 CpG-мотивов, составляющее 96, определяли по формуле:

,

где:

         D1 – размер фрагмента, полученного в результате обработки рCpG-KH11 смесью рестриктаз NdeI и EcoRI и состоящего из клонированной вставки, окруженной фланкирующими участками (п.н.);

280 – суммарный размер фланкирующих участков (п.н.);

         40 – размер 1 тандемного повтора CpG-мотивов (п.н.);

         4 – количество CpG-мотивов в 1 тандемном повторе.

 

В результате проведенных экспериментов по молекулярному клонированию получен штамм-продуцент плазмидной ДНК, обогащенной иммунотропными CpG-мотивами, названный E. coli CpG-KH11. Данный штамм способен продуцировать плазмидную ДНК в количестве 5,5–6,0 мг/л.

Заключение. В результате выполнения данной работы сконструирован вектор рCpG-KH11, несущий 96 повторов иммунотропного CpG-мотива GTCGTT. Судя по литературным данным, полученная плазмида может использоваться как адьювант для повышения эффективности белковых и ДНК-вакцин, а также для терапии и профилактики инфекционных, онкологических и аллергических заболеваний.

 

Литература:

1. Krieg A.M. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects // Ann. Rev. Immunol. – 2002. – Vol. 20. – P. 709–760.

                   2. Олишевский С.В., Козак В.В., Яниш Ю.В., Рыбалко С.Л., Шляховенко В.А. Иммуностимулирующая CpG-ДНК: перспективы клинического применения в онкологии // Онкология. – 2006. – Т. 8, № 2. – С. 209–217.

3. Pat. 7935675 US, Immunostimulatory nucleic acid molecules, 2011.

4. Zhao Q., Temsamani J., Iadarola P.L., Jiang Z., Agrawal S. Effect of different chemically modified oligodeoxynucleotides on immune stimulation // Biochem. Pharmacol. – 1996. – Vol. 51. – P. 173–182.

         5. Pat. 6727230 US. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs, 2004.

6. Carpentier A.F., Auf G., Delattre J.Y. CpG-oligonucleotides for cancer immunotherapy: review of the literature and potential applications in malignant glioma // Front. Biosci. – 2003. – Vol. 8. – P. 115–127.

7. Sparwasser T., Hültner L., Koch E.S., Luz A., Lipford G.B., Wagner H. Immunostimulatory CpG-oligodeoxynucleotides cause extramedullary murine hemopoiesis // J. Immunol. 1999. Vol. 162. P. 2368–2374.

8. Park B.K., Kim D., Rhee J.W., Kim M.S., Seok H.J., Choi S.Y., Park J., Lee Y., Kwon H.J. The production and immunostimulatory activity of double-stranded CpG-DNA // 2010. Vol. 43, N 3. P. 164–169.

9. Hartmann G., Weeratna R.D., Ballas Z.K., Payette P., Blackwell S., Suparto I., Rasmussen W.L., Waldschmidt M., Sajuthi D., Purcell R.H., Davis H.L., Krieg A.M. Delineation of a CpG phosphorothioate oligodeoxynucleotide for activating primate immune responses in vitro and in vivo // J. Immunol. – 2000. – Vol. 164. – P. 1617–1624.

10. Martinez-Alonso S., Martinez-Lopez A., Estepa A., Cuesta A., Tafalla C. The introduction of multi-copy CpG motifs into an antiviral DNA vaccine strongly up-regulates its immunogenicity in fish // Vaccine. – 2011. – Vol. 29, No 6. – P. 1289–1296.

11. Chen Y., Xiang L.X., Shao J.Z. Construction of a recombinant plasmid containing multi-copy CpG motifs and its effects on the innate immune responses of aquatic animals // Fish Shellfish Immunol. 2007. Vol. 23, No 3. P. 589–600.