*119986*

Базуріна Поліна Володимирівна

Національний університет харчових технологій , Київ, Україна

Іститут генетики НАН Украіни, Киів, Україна

Дослідження генетичних та епігенетичних змін генів в епітеліальних пухлинах

Використання мікрочипів є новим напрямом біологічних досліджень, орієнтованим на глобальне вивчення експресії геному на рівні РНК або білків, а також змін, які відбуваються на рівні геномної ДНК. NotI-мікрочипам властиві значні технологічні переваги порівняно з іншими підходами до визначення генетичних та епігенетичних змін: можливість їхньої одночасної детекції в пухлинах.

The use of microarrays is the new direction of biological research, focused on the global study of genome expression at the RNA or protein, as well as changes that occur at the level of genomic DNA. NotI-microarrays characterized by significant technological advantages over other approaches to determining the genetic and epigenetic changes: the possibility of their simultaneous detection of tumors.

Рак є однією з головних причин смертності у всьому світі. За даними ВООЗ, що року хворіють 10 млн осіб. Як стверджує ВООЗ, смертність від раку до 2030 року зросте на 45%, в порівнянні з рівнем 2007 року. За розрахунками фахівців, до 2020 року кількість вперше захворілих на рак в Україні перевищить 200 тис [1].

Вчені всього світу працюють над пошуком нових технологій, які зможуть дозволити покращити діагностику та лікування, або взагалі запобігти появі цієї хвороби. Для цього проводяться дослідження клітинних і молекулярних механізмів онкогенезу. В яких виявили ряд структурних генетичних і епігенетичних змін, які супроводжують процес утворення пухлин. Відповідні зміни відбуваються у різних хромосомах, але саме з абераціями на короткому плечі 3-ї хромосоми людини пов’язана значна кількість типів раку. Делеції на плечі 3р є одними з найчастіших змін у більшості епітеліальних пухлин. Епігенетичні зміни у даній ділянці також відіграють важливу роль у канцерогенезі, коли відбувається одночасне метилування CpG-острівців промоторів тих генів, які неметильовані в нормальних тканинах [2].

 Одним із напрямків сучасної діагностики онкологічних захворювань, який швидко розвивається, являється визначення онкомаркерів за допомогою лабораторних тестів. Онкомаркери – це речовини, наявність яких в організмі людини пов'язана з присутністю чи прогресуванням пухлини. Онкомаркери використовують як один із методів комплексної діагностики онкологічних захворювань. Останнім часом все частіше онкомаркери використовують для оцінки ефективності лікування, раннього виявлення рецидивів та метастазів пухлин, для прогнозу перебігу захворювання [3].

Для подальшого дослідження епігенетичних та генетичних змін генів використовують сучасні технології, такі як мікрочіпи, наприклад NotI-мікрочипи, та мікроарреї, SAGE технологію, пряме сиквенування дає можливість широкомасштабного скринінгу змін експресії, генетичних та епігенетичних змін у пухлинах, порівняно з нормальними тканинами. Це дає змогу виявити, наприклад, інактивацію супресорних генів у пухлинах, що важливо для розуміння механізмів утворення пухлин, визначити специфічні геномні сигнатури досліджуваних новоутворень і сприяти вибору наборів потенційних онкомаркерів для ранньої діагностики раку.

Метод порівняльної геномної гібридизації на мікрочіпах з іммобілізованими ДНК з відомими нуклеотидними послідовностями дозволяє порівнювати число копій гомологічних послідовностей в тестованій пухлинній геномній ДНК і в геномній ДНК з нормальної тканини [4]. Зазвичай при підготовці ДНК-проби сумарну геномну ДНК з нормальної і  з належної тканини мітять двома флуоресцентними барвниками. Ці проби містять повторюванні елементи геному. Використання такого способу приготування ДНК-проб призводить до зниження специфічності гібридизації та зменшенню співвідношення сигнал / фон. Методика "блокування" цих повторів при гібридизації за допомогою CotI-ДНК істотно знижує силу сигналу. Все це значно погіршує роздільну здатність методу. Тому конструювання принципово нових ДНК-мікрочіпів, на яких іммобілізовані NotI-зв'язуючі клони (ділянки геномної ДНК, розташовані близько NotI-сайтів) є важливим для досліджень в генетиці та онкології, бо NotI-мікрочіпи – єдині ДНК-мікрочіпи, що дозволяють аналізувати одночасно як структурні, так і епігенетичні зміни в геномі пухлинних клітин [5].

Технологія мікрочипів являє собою потужний інструмент, що дозволяє аналізувати десятки тисяч генів. Бурхливий розвиток технології дозволяє вивчати не тільки диференційну експресію, але і екзонно-інтрону структуру генів, здійснювати пошук нових генів, виявляти однонуклеотидні поліморфні сайти (SNP, Single Nucleotide Polymorphism) і проводити філогенетичний аналіз [6]. Мікрочіпи використовуються  для ідентифікації пухлинних маркерів, вивчення механізмів дії протипухлинних засобів і в генодіагностиці ряду захворювань [7, 8]. Найбільш відомі ДНК-мікрочіпи з іммобілізованими на них олігонуклеотидами, а також з ДНК, отриманої в результаті використання Р1-, PAC-, BAC-клонів (тобто штучних хромосом, містять геномний фрагмент довжиною від 50000 до 1 млн.п.н.) або кДНК-клонів [3].

Створення нових ДНК – мікрочипів має велике значення, так як може надати інформацію не тільки о генетичних ( делецій, ампліфікації) , але і епігенетичних змінах в геномі пухлинних клітин ( метилювання ДНК, ацетилування гістонів). NotI- мікрочипи – єдині ДНК- мікрочипи, які дозволяють аналізувати одночасно як структурні, так і епігенетичні зміни в геномі пухлинних клітин .

Як відомо, аналіз NotI-клонотеки генома людини дозволив відкрити гени, не виявлені раніше ні в кДНК-, ні в EST-клонотеці. NotI-мікрочіпи дозволяють знаходити зміни навіть у низкоекспресуючихся генах, які не представлені в кДНК-клонотеці нормальних тканин [5].

 NotI-мікрочипи служать ефективним інструментом для виявлення генів, що беруть участь у розвитку злоякісних пухлин, і особливо генів, які пригнічують пухлинний ріст. Відкриття метилювання деяких нових генів - передбачуваних супресорів пухлинного росту – на ранніх стадіях канцерогенезу може стати революційним у діагностиці раку, так як дозволить істотно раніше виявляти і прогнозувати виникнення онкологічного захворювання.

Таким чином, NotI-мікрочипи можуть з успіхом використовуватися для виявлення порушень в геномі пухлинних клітин і являють собою перший етап у шляху відбору найбільш перспективних генів, пов'язаних тим чи іншим чином з виникненням злоякісних клітин.

Використання NotI – мікрочипів має ряд переваг. По-перше в методі використовується рідкощіпляча рестриктаза NotI, сайт впізнавання якої включає два CpG – динуклеотида. Метилювання цитозина в них перешкоджає розщепленню рестриктазою цього сайту. Отже, в випадку гомо- або гемизиготного метилювання NotI- сайта в міченій пробі цей локус відсутній повністю або частково. По-друге, використання частощіплячої рестриктази Sau3AI в парі з NotI дозволяє отримати фрагменти міченої ДНК розміром від 100 до 2000 п.н., а біотінілізований NotI- лінкер дає можливість позбавитися від фрагментів ДНК. В результаті в гібридизаційній пробі представлені в основному короткі NotI – Sau3A-фрагменти ДНК та лише незначна кількість повторів, які залишаються через неминучих методичних похибок. Таким чином, зразок збагачений нуклеотидними послідовностями, гомологічними ДНК із NotI- зв᾿язуючих клонів, іммобілізованих на мікрочипі [9].

Література

1.Федоренко З.П., Гайсенко А.В, Гулак Л.О.,.Горох Є.Л,.Рижов А.Ю, Сумкіна О.В.,.Куценко Л.Б, Романов Д.В. Д.В. Статистика рака в Украине // Бюлетень Національного канцер-реєстру № 10 – «Рак в Україні, 2008-2009.

2. Якубовская Р.И. Современные подходы к биотерапии рака // Российский биотерапевтический журнал. – 2007. – 1,  №3 5 – 14.

3. Тюляндин С.А., Проблема рака в современном обществе //  3 ежегодная Русская онкоконференция (Санкт-Петербург 1999): Тез докл.: – К.: Наук. думка, 1980. – С. 200–201.

4. Pollack J.R., Perou C.M., Alizadeh A.A., Eisen M.B., Pergamenschikov A., Williams C.F., Jeffrey S.S., Bot­stein D., Brown P.O. 1999. Genome-wide analysis of DNA copy-number changes using cDNA microarrays. Nat. Genet. 23, 41-46.

5. Li J., Protopopov A., Wang F., Senchenko V., Petush- kov V., Vorontsova O., Petrenko L., Zabarovska V., Mu- ravenko O., Braga E., Kisselev L., Lerman M.I., Kashu- ba V., Klein G., Ernberg I., Wahlestedt C., Zabarovsky E.R. 2002. NotI subtraction and NotI-specific microarrays to de­tect copy number and methylation changes in whole ge­nomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 10724-10729.

6. Trevino V., Falciani F., Barrera-Saldana H.A. 2007. DNA microarrays: a powerful genomic tool for biomed­ical and clinical research. Mol. Med. 13, 527-541.

7. Su A.I.,Welsh J.B., Sapinoso L.M., Kern S.G., Dimitrov P., Lapp H., Schultz P.G., Powell S.M., Moskaluk C.A., Frier- son H.F. Jr., Hampton G.M. 2001. Molecular classification of human carcinomas by use of gene expression signatures. Cancer Res. 61, 7388-7393.

8. Macgregor P.F. 2003. Gene expression in cancer: the ap­plication of microarrays. Expert. Rev. Mol. Diagn. 3, 185-200.

9. Павлова Т.В., Кашуба В.И., Муравенко О.В.  и др., Технология анализа эпигенетических и структурных изменений хромосомы 3 человека// Молекулярная биология. –2009. –43, №2 –С. 342 – 344.