*120242*

 

                     Биологические науки.

   Молекулярная  биология

 

 К.б.н.  М.В. Гончарова, к.б.н. С.Ю. Королева,  к.б.н.  Т.А. Чуднова,  д.б.н. Ю.Н. Королев,

С.С. Сафонов. 

Международный университет природы общества и человека «Дубна», филиал «Угреша», Россия

 

Методы регистрации изменений

   пространственной организации  

  клеток при воздействии внешних

               факторов среды

 

Введение

Жизнь любого организма - это способ существова­ния в конкретных условиях, который может меняться в зависи­мости не только от возраста, но и от среды существования, где могут присутствовать разнообразные факторы внешнего воздействия как биологической, так и физико-химической природы.  Любая жизнеспособная система зависит от целого ряда проблем, одна из них - взаимодействие со средой обитания. Это обусловлено, с одной стороны, бесконеч­ностью информационной картины мира, и, с другой стороны, конечностью субъективных откликов на нее живой природы. Поэтому полной симметрии между структурой информации и действительностью быть не может.

Многие аспек­ты биологической эволюции от зарождения жизни до развития социальной организации рассматривают через соотношения организма со средой. Такая позиция обуславливается введением понятия «ре­зультат» как универсального системообразующего фактора. Следствием такого подхода явилось то, что организм стали рассматривать как открытую систему, в которой про­текают процессы саморазвития и саморегуляции. Открытость живых систем предполагает возможность взаимодействия со средой обитания. Оно может быть реализовано, прежде всего, через внешние структуры клетки (либо через контакты, либо с помощью химических или физических взаимодействий).

Принято считать, что основа жизни - не борьба за вещество или энергию, а стремление уменьшить структурную энтропию, т.е. борьба за упорядоченность. Выполнение этих требований подразумевает установление связей между со­держанием обмена информации и реальностью, или оценку энтропии информации. В эксперименте выявить такие связи можно, если возможен анализ степени симметрии (асимметрии) информации по отноше­нию к действительности. 

Нас интересовала возможность получения информации, позволяющей судить не только о наличии или количестве в клетках живых объектов важней­ших биополимеров, но и об их пространственном распределении, а также структурной организации в клетках, одним из параметров которой является определенная ориентация в макромолекулах определенных химических связей.

Материалы и методы

В работе были использованы вегетативные клетки и споры анаэробной почвенной  бактерии  Clostridium pectinofermentans  15; цистоподобные рефрактерные клетки (ЦРК) микроорганизмов, образование которых индуцируется  специфическими  ауторегуляторными  факторами, обладающими свойствами мембранных модификаторов; цианобактерии  Anabaena variabilis и галобактерии.

Для оценки состояния объектов исследования и получения сведений о конформационных изменениях в поверхностных слоях объектов был выбран спектральный метод многократно нарушенного полного внутреннего отражения (МНПВО) в инфракрасном диапазоне (ИК), области 1800-1200 см – 1, основанный на неинвазивном анализе. Этот метод обеспечивает нативное исследование объектов и их послойные характеристики, а также может дать может дать информацию о наличии биохимических компонентов, идентифицируемых по их спектральным характеристикам в заранее определенном, измеряемом слое клетки. Спектральные характеристики, полученные в поляризованном свете, дают информацию о тех процессах, которые связаны с пространственной переориентацией отдельных макромолекул.

Результаты и обсуждения

Получены данные о пространственной упорядоченности биополимеров  in situ как в целой интактной споре, так и в заранее определенном,  измеряемом  слое  клетки анаэробной почвенной  бактерии  Clostridium pectinofermentans  15. Установлено,  что внешний слой споры  (0 – 0,25 мкм  - клеточный слой от экзоспориума до внутренней мембраны спо­ры) представляет собой упорядоченную структуру в отличие от вегетативной клетки,  у которой внешний слой изотропен.  При увеличении толщины сканируемого слоя споры  наблюдается  некоторое  снижение анизотропии,  а вегетативной клетки - некоторое повышение. В ито­ге, спора в целом - изотропна, а вегетативная клетка в значитель­ной  степени упорядочена.  Отметим,  что процесс спорообразования сопровождается  структурированием   макромолекулярного   матрикса внешнего слоя клетки.

Следующим объектом исследования были анабиотические цистоподобные рефрактерные клетки (ЦРК) микроорганизмов, образование которых индуцируется  специфическими  ауторегуляторными  факторами, обладающими свойствами мембранных модификаторов, антиоксидантов и химических шаперонов, изменяющих конформацию макромолекул (белков и полисахаридов клеточной стенки). Установлено, что при образовании ЦРК под действием повышающейся  концентрации фактора d1 наблюдается быстрое изменение спектральных характеристик, которые становятся аналогичными таковым у эндоспор и сохраняются, пока ЦРК находятся в анабиотическом состоянии, при этом происходит быстрое изменение параметров и спектральных характеристик культу­ры,  которые  становятся  близкими  к таковым бактериальных спор (упорядоченность внешнего слоя). Причем, если цистоподобным анабиотическим формам были свойственны характеристики, описанные для эндоспор на протяжении всего времени эксперимента, то для гипометаболических  клеток (полученных под действием меньших доз спорообразующего фактора) к концу опыта наблюдался возврат  параметров спектральных характеристик культуры к параметрам,  присущим веге­тативным клеткам. Может ока­заться важным, что возврат этих параметров осуществляется через не­который колебательный процесс. Из этих данных следует, что возврат, его ха­рактер зависят как от дозы действующего на культуру фактора, так и от возраста культуры (полагаем, и состояния культуры), подвергнутой действию фактора. Можно предположить, что экспериментально получаемые цистоподобные формы можно рассматривать как модель для изу­чения некоторых универсальных биологических закономерностей, в том числе для изучения переходных состояний биологических систем в цикле биоз-анабиоз.

Для анализа нативных клеток в процессе взаимодействия культуры цианобактерий Anabaena variabilis с цианофагом  на  разных  этапах культивирования спектральные характеристики регистрировали  в динамике. В опыте использовали 12-суточную концентрированную культуру при соотношении  фаг/клетка 4 частицы на клетку.  Параллельно была инфицирована разведенная в 10 раз культура при том же соотношении фага и клеток.  Опыты показали, что быстрее подвергалась лизису более концентрированная культура. В результате сравнения спектральных характеристик опытных и контрольных культур в тех же концентрациях установлено,  что на начальном этапе изменения спектров менее концентрированной культуры при введении цианофага в среду выражены сильнее,  чем изменения спектров более концентрированной культуры (области 1550 и 1300-1500 см-1).  Однако через несколько часов изменения характеристик в области 1300-1500 см-1 концентрированной культуры также становились значительными. Кроме того, был проведен расчет дихроичных отношений для полос амид 1 и амид 2 для клеток цианобактерий с разной концентрацией цианофага в среде. Из расчетных данных следует, что найти пропорциональную или количественную зависимость между изменениями концентраций фага в среде  и  характером изменений дихроичных отношений  очень трудно.  Таким образом, разбавленная культура на введение в среду цианофага реагирует сильнее,  чем концентрированная, хотя при сильном разбавлении  системы  фаг + клетки  количество контактов фагов и клеток должно уменьшаться и реакция культуры должна была  бы  быть  меньшей.  Дальнейшие эксперименты по изучению спектров цианобактерий при введении в систему фагов в различной концентрации подтвердили сложный характер реакции живой системы на присутствие в среде цианофага. 

На примере  галофильных  микроорганизмов             рассматривалась возможность изучения отличий  делящихся  клеток  гетерогенной  и  синхронной культур при регистрации изменений градиента концентрации биохимических компонентов нативных клеток с помощью анализа изменений  интенсивности полос поглощения и дихроичных отношений. Существенные различия синхронной и несинхронной культур галофилов на спектрах обнаруживаются в области поглощения 1430-1480 см -1.  В литературе  нет  четкой идентификации этих полос поглощения для спектров целых клеток. С нашей точки зрения,  найденные отличия в этой области для практических целей представляют интерес тем,  что она наиболее лабильна во времени. Это  дает основание для ее использования при изучении действия внешних факторов на культуры как способа получения информации об их состоянии. Именно  в этой области наиболее ярко проявляется реакция клеток многих других культур на воздействие внешних факторов. Для делящейся синхронной культуры галофилов отличия спектров от гетерогенной того же возраста наиболее заметны. Отличия синхронной и несинхронной культур обнаружены и при расчете соотношения полос поглощения 1660 и 1550 см-1,  полученных для перпендикулярной составляющей плоскополяризованного света.  Получены расчетные данные для трех периодов развития культуры.  Из полученных данных следует, что  соотношение указанных полос для синхронной и несинхронной культур значительно отличается в период деления. Обращает на себя внимание различие в областях 1240  см-1  (характерной для нуклеиновых  кислот)  и  1740  см-1  (характерной для липидов).  Так в спектре "среза" клеток полоса 1240 см-1 практически отсутствует,  а  в целых клетках она интенсивная.  Полоса же 1740 см-1 значительно интенсивнее для "среза" клеток и менее интенсивна для спектра целых клеток. Регулируя глубину проникновения светового потока можно,  вероятно,  изучать и гетерогенность культуры,  связанную с нестабильностью пространственного положения биополимеров в клетке.  Измеряя изменение соотношения полос поглощения (например,  амид 1 и амид 2), также можно получить представление о биохимической гетерогенности культуры в процессе развития. Расчет дихроичных отношений спектров с разных глубин проникновения света для синхронной и  несинхронной культур показал, что клеткам свойственна определенная степень упорядоченности находящихся в них биополимеров, которая исчезает  для  слоя,  затрагивающего лишь клеточную стенку и мембрану, что,  можно полагать, является следствием скрытой анизотропии. Результаты полученные для несинхронной культуры практически совпадают со сказанным выше,  а для синхронной  -  значительно отличаются: для синхронной культуры анизотропия наблюдается даже в тех областях поглощения,  где она не выявлена для несинхронной.  Этот факт подтверждает  предположение  о  наличии скрытой анизотропии,  которая, возможно,  является также следствием гетерогенности несинхронной культуры клеток. Наиболее существенные отличия и в этом случае наблюдаются во время деления  клеток  синхронной  культуры.  При  рассинхронизации культуры  величины  дихроичных отношений практически стали совпадать с величинами, характеризующими несинхронную культуру.

Полученные результаты дают основание предположить, что изменения, происходящие в клетках в период деления,  можно использовать для получения информации при изучении популяций,  в том числе и об уровне "организованности" различных культур клеток в  процессе  развития.  Кроме того, является перспективным использование синхронных культур клеток в качестве одного из "инструментов" исследования  поведения  популяций микроорганизмов при воздействии факторов внешней среды как физико-химического, так и биологического происхождения.

Анализируя спектры поглощения клеточных структур представленных объектов, можно констатировать, что существует четкая зависимость величины полученных спектральных данных от возраста культуры и истощением питательной среды в процессе культивирования.

Выводы

1. Проведен анализ влияния различных факторов внешней среды на распределение и пространственную упорядоченность биополимеров in situ в вегетативных клетках бактерий, цианобактерий, галобактерий, а также в эндоспорах и анабиотических клетках бактерий.

2. Получена информация о наличии биохимических компонентов, идентифицируемых по их характеристиче­ским полосам поглощения, как в целой клетке, так и в заранее опреде­ленном, измеряемом слое клетки, что позволяет определять динамику изменения гетерогенности. Спектральные характеристики, полу­ченные в линейно поляризованном свете, позволяют иметь ин­формацию о тех процессах, которые выражаются в пространственной переориентации отдельных (например, белковых) макромолекул. Можно предположить, что преимущественная ориентация определен­ных химических связей в ансамблях макромолекулярных компонентов клетки (что находит отражение в спектрах) может характеризовать in vivo организованность биосистемы (соответственно и ее функциональ­ное состояние)  в определенный момент времени.

3. Биологическую систему можно представить как совокупность огромного числа резонансных систем, образованных молекулами и молекулярными комплексами, способными лабильно менять свои резонансные характеристики в зависимости от различных структурных изменений, что позволяет сохранять целостность системы в среде обитания. С этих позиций становится очевидным резонансный механизм влияния факторов среды  обитания на живые организмы разного уровня развития.

Литература

1. Гусев М.В., Королев Ю.Н. О взаимосвязи эволюции живых систем и их «открытости». Синергетика, т.7, М., МГУ, 2004, с. 150-169.