*117870*

Суханова Е.В.¹, к.б.н. Дзюба Е.В.¹, к.б.н. Деникина Н.Н.¹,

к.б.н. Белькова Н.Л.¹

¹Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук, Россия

ТАКСОНОМИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ КИШЕЧНОЙ МИКРОФЛОРЫ представителей рода THYMALLUS

Современные исследования ассоциированной микрофлоры рыб позволяют классифицировать ее как автохтонную или собственную, и аллохтонную или транзиторную. Филогенетическая идентификация отдельных микроорганизмов в сообществах без культивирования является мощным инструментом в комплексном изучении микрофлоры рыб, так как позволяет получить наиболее полную характеристику ее видового состава. Цель работы: определение таксономического разнообразия кишечной микрофлоры представителей рода Thymallus.

Сбор рыб проводили с использованием жаберных сетей, которые выставлялись на глубинах 0,5–8,0 м. Материал обработан по общепринятым в ихтиологии методикам [1]. Для выделения суммарной ДНК использовали разные отделы кишечного тракта (КТ), взятые у свежевыловленных рыб в асептических условиях. Для проведения молекулярно-генетических исследований использовали предложенный ранее подход [2].

Молекулярно-генетический анализ выявил доминирование представителей двух фил бактерий (Proteobacteria и Tenericutes) в кишечной микрофлоре черного байкальского (Thymallus baicalensis) и ленского хариусов (T. baicalolenensis) из всех проанализированных мест обитания (таблица). Дополнительно в хариусах из разных мест обитания детектированы представители фил Spirochaetes (р. Ангара, оз. Тухурен-Нур, р. Чечуй), Firmicutes (р. Большая Тира) и Bacteroidetes (оз. Тухурен-Нур).

Таблица. Разнообразие кишечной микрофлоры хариусов из разных мест обитания, 2006–2011 гг.

Дата и место сбора	Виды рыб	Автохтонная микрофлора	Аллохтонная микрофлора
Озеро Байкал, 2007–2011 гг.	черный байкальский хариус	Acinetobacter Enterobacter Salmonella Escherichia Caulobacter Sphingomonas Delftia Aeromonas Mycoplasma	Pseudomonas Stenotrophomonas Comamonas Bradyrhizobium Azospirillum
Река Ангара в черте г. Иркутск, 2006–2011 гг.	черный байкальский хариус	Brevinema Salmonella Mycoplasma	Pseudomonas
Озеро Тухурен-Нур (Восточные Саяны, Республика Бурятия), 2009 г.	черный байкальский хариус	Mycoplasma Spironema Deefgea Deltaproteobacteria Flavobacterium
Река Чечуй (Киренский район), 2009 г.	ленский хариус	Mycoplasma Brevinema
Река Большая Тира, 2008 г.	ленский хариус	Aeromonas Plesiomonas Clostridium	Collimonas

К аллохтонной микрофлоре отнесены преимущественно представители протеобактерий, такие как Azospirillum, Bradyrhizobium, Comamonas, Stenotrophomonas и Pseudomonas (Pseudomonas sp., P. putida, P. stutzeri, P. reactans и P. rhodesiae), наличие которых может быть связано с их присутствием в байкальской воде или в ассоциациях с кормовыми объектами рыб. Вид Collimonas sp. (класс Betaproteobacteria, сем. Oxalobacteraceae), выявленный в кишечнике ленского хариуса из р. Большая Тира, является строгим аэробом, поэтому также отнесен к аллохтонной микрофлоре.

ﾐ珸濵髜鉅・ ・・・瑙韈・・, ・・ ・胚・ 磊 ⅳ淲燾 ・ 珞・濵・ ・・ⅵ・, 籵頏・ ・ 魵 韈 鈿顥 ・ 髜頸瑙・. ﾂ 裹 珞・ ・ ・ 韈 鰀褞・ ﾁ琺・・ ⅰ蒟・燾 硴韆琺・ 蓴褊湜・ Caulobacter sp. ・ Sphingomonas sp. (・瑰・ Alphaproteobacteria), ・・ 韲・・ 糺・ 胛・・肛 ・ 淲・・粨褌隯・ 矜・褞・・, 糺蒟・澵隯・ 韈 ・鵫 ・・ⅵ・ 鉈顆燾・ ⅱ聰湜銕魵: Ctenopharyngodon idellus (FR853581), Tamarixia radiata (EF433789), Sphenophorus levis (FJ626264), Nilaparvata lugens (FJ774970) 齏・ 韈 ・韶頷 瑰璋韜 Eriocheir sinensis (DQ856499), 瑙・ (DQ860013) ・ 瑙頷 ・ [3]. ﾍ・ⅳ鞴浯 ・裝魵瑣褄・ⅲ ﾎ1-10 胛・・肛・ ・裝魵瑣褄・ⅲ Delftia sp. (HM587796) (・瑰・ Betaproteobacteria, ・. Comamonadaceae), ・・澵鵫 韈 ・韭・ 頸魵. ﾄ肛・ 韈粢燾・ ・裝珞頸褄・ 胛 萵 D. tsuruhatensis ・ D. lacustris 韈鸙頏魵瑙・ 韈 ・褥濵・ 粽蕘, ⅲ髜燾 銜瑣・ ・・鞴魲・・・ ・ ・・粱・ 浯鈿・ 瑕粹ⅲ [4]. ﾊ・ 胛, ⅳ・濵 ・頌粨・ ・裝珞頸褄裨 蒡・ Enterobacter, Salmonella ・ Escherichia (・瑰・ Gammaproteobacteria, ・. Enterobacteriaceae), ・裝湜・ 韲・・ 糺・ 胛・・肛 (99%) ・ ・・・瑙韈・・, ・・粨籵澵隯・ 韈 ・韭・ 浯・・・ (HQ407235, HQ154567). ﾅ 鮏竟 ・裝珞頸褄・ ・瑰 Gammaproteobacteria 韲裹・ ・ 胛・・肛裨 100% 硴韆琺胛 ・・粨褌魲・ 蓴褊湜・ Aeromonas salmonicida (GQ266405, ・. Aeromonadaceae), 糺蒟・澵魲・ 韈 ・褥濵粽蓖魲・ 瑣・炅顆褥・胛 ・・ ・・ 瑣韵顆濵・ 渼裼・. ﾂ ・鵫 ・・ⅵ・ ・魲頷 粨蒡・ ・ ⅳ・濵 ・頌粨・ 矜・褞韜 萵 Aeromonas [5-8], ・魲韃 粨蕘 ・胛 粱 頷ⅰ瑣魲褊瑟・.

В кишечнике рыб из оз. Тухурен-Нур определены последовательности бактерий рода Deefgea (класс Betaproteobacteria, сем. Neisseriaceae), ближайший родственник которых получен молекулярными методами из кишечной микрофлоры радужной форели [7]. Вместе с тем детектирована последовательность класса Deltaproteobacteria, ближайший некультивируемый родственник (FJ456666), выделенный из кишечника антарктических рыб имеет гомологию 96% [3]. Ближайший культивируемый родственник – Lawsonia intracellularis (сем. Desulfovibrionaceae) с гомологией 86%, является внутриклеточным кишечным симбионтом [9].

В кишечнике ленского хариуса из р. Большая Тира, кроме представителей рода Aeromonas, определены последовательности бактерий рода Plesiomonas (класс Gammaproteobacteria, сем. Enterobacteriaceae). Один из видов этого рода, Plesiomonas shigelloides, детектирован в кишечниках тепловодных рыб [5, 8, 10].

Следует отметить еще две крупные таксономические группы, представители которых также могут быть отнесены к автохтонной микрофлоре: это фила Firmicutes и фила Bacteroidetes у рыб из р. Большая Тира и озера Тухурен-Нур, соответственно. Последовательности Н98-05 и Н98-11 имеют гомологию с Clostridium sp. (фила Firmicutes, сем. Clostridiaceae). Ранее в кишечной микрофлоре рыб детектировали представителей рода Clostridium [5, 8, 11 и др.], так с помощью молекулярно-генетических методов показано доминирование представителей этого рода в КТ радужной форели [5]. Последовательность X9-11 идентична Flavobacterium sp. (фила Bacteroidetes, сем. Flavobacteriaceae). Бактерий этого рода культивировали из КТ различных видов рыб [5, 12] и детектировали молекулярно-генетическими методами [5]. Флавобактерии нетребовательны к кислороду, выживают в микроаэрофильных и анаэробных условиях, а некоторые виды являются патогенными для рыб.

Следующей крупной таксономической группой, детектируемой во всех рыбах рода Thymallus, являются представители филы Tenericutes. Ближайшие родственники – последовательности некультивируемых микоплазм (класс Mollicutes, сем. Mycoplasmataceae) – получены клонированием из КТ антарктических рыб N. coriiceps [3] и «шотган»-секвенированием транскриптома радужной форели O. mykiss (EZ764760), а ближайший культивируемый родственник с гомологией 95% – Mycoplasma moatsii. Кроме этого, микоплазмы были детектированы молекулярно-генетическими методами в КТ различных видов рыб [3, 5, 6, 8, 13].

Дополнительно к вышеперечисленным микроорганизмам в хариусах из рек Ангара и Чечуй, а также озера Тухурен-Нур были детектированы представители филы Spirochaetes, которые имеют гомологию 93–95% с некультивируемыми спирохетами, выделенными из кишечников различных видов рыб [6, 13], и 90% – с последовательностью типового штамма Brevinema andersonii (L31543) (сем. Brevinemataceae). Отдельный кластер формируют последовательности из КТ хариуса из озера Тухурен-Нур, ближайший культивируемый родственник которых – Spironema culicis (AF166259). Спирохеты – известные патогенные микроорганизмы, в последнее время все чаще детектируются в КТ различных пойкилотермных и гомойотермных животных.

Таким образом, в кишечнике рыб рода Thymallus определены генотипы различных микроорганизмов, которые можно отнести как к автохтонной, так и аллохтонной микрофлоре.

Работа выполнена в рамках программы РАН № 30, подпрограммы 1, проект 30.13.

Литература:

1. Правдин И. Ф. Руководство по изучению рыб (преимущественно пресноводных). – М.: Пищевая промышленность, 1966. – 376 с.

2. Суханова Е.В., Дзюба Е.В., Деникина Н.Н., Русинек О.Т., Белькова Н.Л. Поиск факторов, определяющих разнообразие генотипов кишечной микрофлоры черного байкальского хариуса. // Известия ИГУ. Серия Биология. Экология. – 2009. – Т. 2. – № 1. – С. 127–132.

3. Characterization of the intestinal microbiota of two Antarctic notothenioid fish species / N. L. Ward [et al.] // Extremophiles. – 2009. – Vol. 13. – P. 679–685.

4. Delftia lacustris sp. nov., a peptidoglycan-degrading bacterium from freshwater and emended description of D. tsuruhatensis as a peptidoglycan-degrading bacterium / N. O. G. Jorgensen [et al.] // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. – 2009. – Vol. 59. – No. 9. – P. 2195–2199.

5. Kim D.-H. Microbial diversity of intestinal contents and mucus in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) / D.-H. Kim, J. Brunt, B. Austin // J. Appl. Microbiol. – 2007. – Vol. 102. – P. 1654–1664.

6. Dominance of Mycoplasma in the guts of the long-jawed mudsucker, Gillichthys mirabilis, from five California salt marshes / N. Bano [et al.] // Environ. Microbiol. – 2007. – Vol. 9. – P. 2636–2641.

7. Phylogenetic analysis and in situ identification of the intestinal microbial community of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) / I. Huber [et al.] // J. Appl. Microbiol. – 2004. – Vol. 96. – P. 117–132.

8. Phylogenetic analysis of intestinal microflora indicates a novel Mycoplasma phylotype in farmed and wild salmon / W. E. Holben [et al.] // Microb. Ecol. – 2002. – Vol. 44. – P. 175–185.

9. Ileal symbiont intracellularis, an obligate intracellular bacterium of porcine intestines showing a relationship to Desulfovibrio species / C. J. Gebhart [et al.] // Int. J. Syst. Bacteriol. – 1993. – Vol. 43. – No. 3. – P. 533–538.

10. Austin B. Bacterial fish pathogens: disease of farmed and wild fish Jointly published with Praxis Publishing / B. Austin, D. A. Austin. – UK 4th ed., 2007. – Vol. XXVIII. – 552 p.

11. Moran D. Ontogenetic development of the gastrointestinal microbiota in the marine herbivorous fish Kyphosus sydneyanus / D. Moran, S. J. Turner, K. D. Clements // Microb. Ecol. – 2005. – Vol. 49. – P. 590–597.

12. Ringo E. Intestinal microflora of salmonids: a review / E. Ringo, E. Strom, J.-A. Tabachek // Aquac. Res. – 1995. – Vol. 26. – P. 773-789.

13. Molecular identification of intestinal microflora in Takifugu niphobles / A. Shiina [et al.] // Com. Biochem. Physiol. – 2006. – Vol. 1. – P. 128–132.