Аспетов ДР., Омарова М.Н., Оракбай Л.Ж.,

Жуматова Б.Х., Шакетова Н.Т.

Научный центр гигиены и эпидемиологии им. Хамзы Жуматова, Алматы

ИЗУЧЕНИЯ ВЛИЯНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКОГО ПЕСТИЦИДА НА ПРОДУКЦИЮ ИНТЕРФЕРОНА КЛЕТКАМИ ЧЕЛОВЕКА

В настоящее время пестициды относят к группе лидеров среди экзогенных загрязнителей биосферы [1]. Экспериментально-клинические наблюдения показывают, что действие пестицидов в малых дозах провоцирует возникновение различных заболеваний в отдельных органах, системах и организме в целом, повышая заболеваемость гепатитом, болезней органов дыхания и пищеварения, сердечно-сосудистой и нервной системы и гинекологическими патологиями [2,3].

Влияние пестицидов на активность различных компонентов иммунной системы, в частности, цитокинов, изучено недостаточно. Цитокины –продукты секреции иммунокомпетентных клеток организма представляют собой группу гормоноподобных белков и пептидов, регулирующих межклеточные взаимодействия. Благодаря цитокинам регулируются согласованные действия иммунной, эндокринной и нервной системы в нормальных условиях и в ответ на патологические воздействия[3]. Важнейшей системой цитокинов, участвующей в иммунологической защите организма против инфекций, токсинов и других чужеродных воздействий на организм является система интерферона, которая представлена группой низкомолекулярных белков-гликопротеидов, обозначенных символами α/β и γ- и являющихся продуктом секреции иммунокомпетентных клеток. Подавление функциональной активности клеток, вырабатывающих интерфероны, способствует возникновению вторичной иммунной недостаточности, развитию бактериальных осложнений [4].

Данных по влиянию фосфорорганического пестицида нового поколения - глифосата на систему интерферона в доступной литературе мы не обнаружили.

Цель исследований. Изучить действие фосфорорганического пестицида (гербицида) глифосата (ГФ) на способность клеток к продукции α/β- интерферона (ИФН) на модели перевиваемой линии клеток человека RD.

Материалы и методы. В работе использовали перевиваемые клетки человека линии RD. Клетки выращивали в 96-луночных луночных пластиковых планшетах фирмы «BD Falcon» в среде 199 с 10% телячьей эмбриональной сывороткой (ТЭС). Посевная доза составляла 10⁴ кл/лунка. Планшеты помещали в камеру, содержащую 5% СО₂, при температуре 37°С. Вирусы: ВБН – вирус болезни Ньюкасла – индуктор интерферона.

В качестве индикаторного тест- вируса использовался вирус энцефаломиокардита мышей ЭМК. За единицу активности ИФН (ед/мл) принимали величину, обратную его максимальному разведению, которое защищало 50% клеток от действия 100 ТЦД_50/мл ( тканевых цитопатогенных доз) вируса ЭМК. В качестве контроля использовали референс препарат ИФН для перевода полученной активности в международные единицы (МЕ).

Статистическую обработку проводили с применением программы Statistica. [5]. Определялось среднее арифметическое (М) и стандартное отклонение (m).

Результаты Определение минимальной концентрации ГФ, вызывающей 50% цитотоксическое действие (ЦД₅₀ ) на клетки RD проводили микрометодом в 96- луночных планшетах. В лунки с с монослоем клеток вносили разведения ГФ в ростовой среде в присутствии 10% ТЭС, начиная от 1:500 (0,05 мг/1,0 мл ) и далее 1 :1000, 1:2000, 1:4000, 1:8000, 1: 16000, 1: 32000. В контрольные лунки вносили ростовую среду, не содержащую ГФ. Клетки помещали в термостат при t 37°С в камере с 5% СО_2. За состоянием монослоя в течение наблюдали под контролем инвертированного микроскопа в течение 12, 24, 48, 72 часов. На момент окончания эксперимента в монослое культуры клеток в контрольных лунках в дегенерации не наблюдалось. Нами было отмечено, что уже в первые 12 часов в монослое опытных клеток, обработанных ГФ в разведении 1:500 и 1: 1000 наблюдалась округление клеток под действием ГФ, свидетельствующее о дегенеративных изменениях в клеточном монослое. В разведении ГФ 1:1000 наблюдалось ощелачивание ростовой среды опытных клеток, свидетельствующее о снижении их жизнеспособности, в сравнении с неизмененными клетками в контроле. В клетках с разведениями ГФ 1: 2000 монослой клеток частично сохранился. Начиная с разведения ГФ 1: 4000 и выше до 1:32000 состояние клеток в монослое оставалось без изменений.

В дальнейших исследованиях применялось исходное разведение ГФ 1: 5000 (0,005мг/мл), не оказывающее видимого цитотоксического действия на клетки при сохранении их способности к продукции интерферона.

Изучение действия ГФ на продукцию – α/β интерферона клетками человека RD в зависимости от времени контакта.

Перевиваемые клетки человека линии RD выращивали в 96 луночных пластиковых панелях. На сформировавшийся монослой наносили по 0,005 мг/мл ГФ, растворенного в среде 199 с 10% ТЭС и помещали в термостат при t 37°С в СО₂ -камере на 24 часа. Затем среду, содержащую ГФ, удаляли, клетки дважды отмывали средой 199 и вносили по 10^5,5 lg вирус-индуктор ИФН- ВБН, после чего панели с клетками инкубировали при t 37°С в СО₂- камере 24 часа. Пробы культуральной среды отбирали и после обработки тестировали в них активность ИФН. Результаты показали, что контрольные клетки, не подвергшиеся воздействию ГФ в течение 5 суток наблюдения продуцировали ИФН с, практически, одинаковой активностью 280±31,8 – 228 ±14,6 ед/мл). На этом фоне клетки RD, обработанные ГФ в течение 2-3 суток, полностью утратили способность продуцировать интерферон.

Рисунок 1. Влияние глифосата на интерфероногенез в клетках RD, индуцированных вирусом ВБН, в зависимости от времени контакта ГФ

На монослой клеток RD, выращенных в 96- луночных планшетах вносили по 0,005 мг/мл ГФ после чего клетки выдерживали при t +37°С, в СО₂- камере в течение 24, 48, 72, 96, 120 часов. Затем питательную среду из лунок отбирали, монослой отмывали средой 199 и вносили в лунки по 5,5 lg ЭИД₅ вирус –индуктор ВБН._. Планшеты помещали при t +37°С на 24 ч, после чего пробы из лунок собирали, обрабатывали и испытывали на активность α/β-интерферона.

Результаты титрования представлены на рисунке 1. Они показывают, при контакте ГФ с клетками в течение 24 часов продукция ИФН снижалась с 960±84,6 ед/мл в контроле до 53±12,4 ед/мл. Дальнейшая инкубация клеток с ГФ приводила к последовательному уменьшению титров ИФН. В пробах, взятых через 120 часа активность ИФН составила 14±1,3 ед/мл.

Влияние различных концентраций ГФ на продукцию α/β –интерферона, клетками RD, индуцированных вирусом ВБН.

В 96-луночные планшеты вносили перевиваемые клетки RD в посевной дозе 1х10⁴ клеток/мл в среде 199 с 10% ТЭС. Планшеты помещали в термостат при t 37°С в СО₂ – камере на 24 часа. На сформировавшийся монослой наносили различные концентрации ГФ от 0,00002 до 0,005 мг/мл в среде 199 и выдерживали при t 37°С в течение 24 часов, после чего ГФ- содержащую среду удаляли. Монослой клеток дважды промывали, затем в лунки вносили по 5,5 lg ЭИД₅₀ вируса ВБН.

После дополнительной инкубации панелей с клетками в термостате в течение 24 часов, пробы поддерживающей среды из лунок собирали, обрабатывали и определяли в них активность α/β- интерферона.

На рисунке 2 представлены результаты титрования ИФН. Они показывают, что контрольные клетки, не подвергшиеся контакту с ГФ, продуцировали α/β-интерферон с активностью 960±18,05 ед/мл. Наименьшая концентрация ГФ, взятая в опыт – 0,00002 мг/мл, приводила к подавлению процесса образования ИФН до 485±21,0 ед/мл. Повышение концентрации ГФ влияло на продукцию ИФН: с увеличением концентрации ГФ, воздействовавшего на клетки, параллельно проявлялось его ингибирующее влияние на продукцию ИФН. Доза ГФ, взятая в исходной концентрации – 0,005 мг/мл, не вызывающей цитотоксического действия, подавляла продукцию ИФН до 12±,1,4 ед/мл.

Влияние длительного воздействия глифосата на клетки RD

На монослой клеток RD, выращенных в пластиковых панелях вносили по 50 мкг/мл ГФ. Клетки инкубировали при t 37°С в СО₂ -камере в течение 24, 48, 72, 96, и 120 часов. Затем ГФ содержащую среду удаляли, отмывали и вносили по 5,5 lg вирус-индуктор ВБН. Через 24 часа из лунок пробы из лунок собирали, обрабатывали и тестировали на содержание ИФН.

Рисунок 2 – Действие различных концентраций глифосата на продукцию интерферона в клетках человека RD.

Результаты представлены на рисунке 3. Они показывают, что с увеличением продолжительности воздействия ГФ на клетки увеличивалось ингибирующее влияние ГФ на продукцию ИФН.

1 - титры интерферона в контрольных пробах;

2 - титры интерферона в пробах клеток предварительно

обработанных ГФ.

Рисунок 3. Активность интерферона в клетках RD

Клетки, обработанные ГФ в течение 2-3 суток, полностью утратили способность продуцировать интерферон. Контрольные клетки, не подвергшиеся воздействию ГФ в течение 5 суток наблюдения продуцировали ИФН с, практически, одинаковой активностью 280±31,8 – 228 ±14,6 ед/мл).

Известно, что клетки клетки лейкоцитарного и липидного спектров крови наиболее чувствительны к воздействию пестицидов [1,2]. В этой связи актуальной проблемой является изучение действия пестицидов и продуктов их трансформации в тканях и органах человека [7].

Результаты проведенных исследований показали, что пестицид глифосат оказывает ингибирующее действие на продукцию α/β - ИФН клетками человека в концентрации, не вызывающей цитотоксического действия клетки (0,005мг/мл) более, чем в 2 раза. Увеличение дозы пестицида, а также времени его контакта с клетками приводит к прямопропорциональному снижению активности выработки ИФН: с 960±18,05 ед/мл в контроле клеток без ГФ и до 485±21,0 ед/мл в опытных клетках, обработанных ГФ.

В наших опытах воздействие глифосата на клетки в дозе 0,05 мг/мл течение 120 часов вызывало полное падение продукции ИФН через 48-72 часа, что, по- видимому, связано с явлением функциональной кумуляции препарата, вызывающее токсический эффект, когда происходит суммирование не самого яда, а его следовых реакций [8].

Проведенные исследования свидетельствуют о необходимости установления систематического контроля за определением остаточного содержания пестицидов в продуктах питания, объектах внешней среды и активного поиска средств преодоления токсического воздействия этих химикатов на организм.

Список литературы.

1 Домшлак М.Г., Макарова-Землянская Е.Н. // Медицина труда и промышленная экология. – 2009. -№ 10. – С.45 – 48.

2.Панина Н.К. Лабораторный контроль за остаточным количеством пестицидов в окружающей среде // Гигиена и санитария. -2010.- № 3. – С.77- 80.

3 Справочник по пестицидам (гигиена применения и токсикология) / Под ред. Клетки, обработанные ГФ в течение 2-3 суток, полностью утратили способность продуцировать интерферон. Контрольные клетки, не подвергшиеся воздействию ГФ в течение 5 суток наблюдения продуцировали ИФН с, практически, одинаковой активностью 280±31,8 – 228 ±14,6 ед/мл).

Л.И.Медведя. – Л., 1997.

4 Кремлева Е.А., Черкасов С.В. Продукция цитокинов вагинальными эпителиоцитами в процессе взаимодействия с доминантными и ассоциативными микросимбионтами // Журн.микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 2012 . - № 4. – С.114-118.

5 Кареткина Г.Н. Применение индукторов интерферонов для лечения и профилактики гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций // Лечащий врач. - № 10. – 2009. – С. 36-41.

6.Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ Statistica. М., 2006.

7 Мельников Н.Н. Пестициды – химия, технология, применение. – .-1990

8 Методы гигиенической и токсикологической оценки биологического действия пестицидов. М., Медицина, 1977, С .36-37.