Биогические науки/Биоинженерия и биоинформатика

Получение иммунной сыворотки к эстрадиолу 17В

к.в.н.Рыщанова Р.М., Ибрагимов П.Ш., Чужебаева Г.Д., Коканов С.К.

Костанайский государственный университет им. Ахмета Байтурсынова, Республика Казахстан

В современном мире гормональные стимуляторы роста применяют не только для терапевтических целей,но такжепри выращивании животных и птиц с целью стимуляции их роста и развития. Широкое распространение получили стероидные-половые гормоны,эстрадиол, тестостерон, прогестерон и их синтетические производные,аналоги, обладающие выраженной анаболической активностью. Однако наряду с ихполезностью стимуляторы загрязняют продовольственное сырьё и пищевые продукты. Синтетические гормоны, в отличие от природных аналогов более устойчивые, плохо метаболизируются и скапливаются в организме животных в значительныхколичествах, мигрируя по пищевой цепи в продукты питания. Они способны переходить в мясо, молоко животных, яйца птиц, другие продукты и оказывать токсическое аллергическое и канцерогенное действие на организм человека. Снизить риск загрязнения продовольственного сырья гормональными стимуляторами можно только при эффективной системе контроля на всех стадиях – от производства до реализации. Вследствие этого к методам массового контроля вредных соединений в сырье и продуктах животного происхождения предъявляются жесткие требования - они должны обеспечивать высокую чувствительность, селективность определения, достоверность и воспроизводимость получаемых результатов.

Целью настоящей работы было получение поликлональных антител к гаптену эстрадиол 17β, пригодных для разработки вариантов иммуноферментного анализа для обнаружения эстрадиола 17β в сырье и продуктах животного происхождения.

Методы и материалы

Получение препаратов конъюгатов эстрадиола 17β.Было апробировано три способа конъюгации гаптенаэстрадиола17βс высокомолекулярными носителями, бычьим сывороточным альбумином (БСА), овальбумином(ОВА) и коллоидным золотом с использованием в качестве сшивающих агентов цианамида (cyanamide) производства MPBiomedicals (США) и глутарового альдегида (Fluka, Швейцария).

Иммунизация животных.Для выполнения научноой работы использовали лабораторных животных - кроликов.Отработка оптимальных схем иммунизациилабораторных животных конъюгатамиэстрадиол-БСА, эстрадиол-ОВАи эстрадиол с коллоидным золотом. Для иммунизации по принципу аналогов были сформированы три группы кроликов по три головы в каждой, весом 2,5– 3,5кг.До начала иммунизации проводили отбор проб крови (по 5 мл.), с последующим анализом преиммунной сыворотки на кроссреакцию с препаратом конъюгатами. Полученные пробы сывороток были разделены на аликвоты с целью последующего использования в качестве отрицательного контроля.

Тестирование полученных сывороток. Тестирование полученных сывороток на наличие специфических антител проводили в непрямом варианте иммуноферментного анализа (ИФА), и в реакции иммунной диффузии (РИД). Для проведения ИФА ячейки 96-луночного планшета для иммунологических реакций сенсибилизировали гетерологичнымконъюгатомэстрадиола на фосфатно-солевом буфере (ФСБ) pH 7,2-7,4 в разных концентрациях (5-10 мкг/мл.), при 4^°С в течение ночи. Постановку реакции осуществляли в стандартном варианте. Результаты ИФА учитывали с помощью спектрофотометра. Реакцию иммунодиффузии проводили по методу O.Ouchterlony с гетерологичнымконъюгатомэстрадиола на 1% - ной агарозе.

Очистка сывороток.Очистку поликлональных сывороток от антител к носителям проводили по методу Кастеллани, основанный на их адсорбции (истощении) избытком соответствующего белка. Методом титрования были определены оптимальные параметры абсорбции.

Результаты исследования

В результате конъюгированияэстрадиола с носителями были получены пробные серии препаратов в количестве 5 мл каждого.Проведенаиммунизациикроликов полученными коньюгатами. В результате тестирования в ИФА было определено, что все препараты конъюгатов обладают свойством вызывать иммунный ответ. При этом наиболее высокий титр антител по отношению к эстрадиолу, показали пробы сывороток крови от кроликов иммунизированных конъюгатомэстрадиол-БСА. Титры антител, специфичных к антигенным детерминантам гаптена-эстрадиола были в пределах 1:800-1:3200.

От животных с наиболее высоким титром специфичных антител схема №1были получены поликлональные специфические сыворотки. Проведено выделение из сывороток крови специфических иммуноглобулинов методом сульфат-аммонийноговысаливания и очистка методом хроматографии.

Выводы

Таким образом, тестирование показало, что использованный в качестве конъюгатаэстрадиол-БСА обладает необходимым уровнем антигенности. Максимальный уровень иммунного ответа на введение большинства растворимых антигенов достигается через 40-60 дней после первой инъекции. Титры антител к антигенным детерминантам эстрадиола при этом находились в пределах 1:800-1:3200 в ИФА и 1:2-1:4 в РИД.

Литература

1 Бутенко Р.Г. и др. Клеточная инженерия.серия Биотехнология №3/ М.: «Высшая школа», 2001.

2 Ковалев И.Е., Полевая О.Ю. Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным соединениям. М 1985.

3 Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М. 1991.

4 Д.Кэтти Антитела. Методы. М., Мир, 1991.

5 А. Ройт, Дж. Брюсстофф, Д. Мейл. Иммунология- М.: Мир, 2000 — ISBN 5-03-003362-9 Иммунология в 3 томах / Под. ред. У. Пола.- М.:Мир, 1988

6 Goding J. Antibody production by hybridoma //J. Immunol. Meth. – 2009. - Vol. 39, № 1. - P. 285-308.

7 Ouchterlony O. Diffusion – in gel methods for immunological analysis// Prog. Allergy. – 1958. – V. 5. – P. 1-78.

8 Панин А.Н., Комаров А.А. Проблемы аналитического контроля безопасности кормов и продукции животноводства. Химия в ветеринарии. Рос.хим.ж., №3 2005.