Ветеринария
/ 1.
д.в.н.
Анников В.В.1, Гессе И.Ю.1,
к.т.н.
Родионов И.В.2, студ. Карпова А.И.1
Саратовский
государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова1
Саратовский
государственный технический университет2
Клинико-рентгенологический мониторинг и динамика изменения биохимических
показателей крови кроликов на фоне оптимизации репаративного остеогенеза рекомбинантным
интерлейкином-2 человека
Большое внимание в последнее время уделяется оптимизации репаративного остеогенеза. Для улучшения результатов лечения больных с переломами костей и другими ортопедическими патологиями многими авторами (Г.И. Илизаровым, П.Н. Анкиным, М.Я. Баскевичем и др.) были разработаны устройства и аппараты для стабильной фиксации костных фрагментов в заданном взаимном положении. Наряду с этим много работ посвящено внедрению различных биологических и физических способов стимулирования образования костной мозоли при лечении травматологических больных методом остеосинтеза [1, 2].
Доказано, что при травме любого генеза возникает
иммунодефицитное состояние [3]. При исследовании остео- и иммуногенеза выявлена
отчетливая корреляционная связь между состоянием иммунной системы и репаративными
процессами в костной ткани, а также характером течения послеоперационного
периода.
В тоже время при использовании рекомбинантных цитокинов в
медицинской практике достигнуто повышение эффективности иммунной терапии и лечения
в целом. Это особенно важно в условиях тяжелой или хронической патологии, когда
применение традиционных иммуномодуляторов или индукторов синтеза цитокинов
становится безуспешным из-за истощения компенсаторных возможностей иммунной
системы.
В связи с вышесказанным,
нами проведены клинико-рентгенологический мониторинг и оценка биохимических
показателей крови у экспериментально больных животных, а также обоснован
научный подход к вопросам эффективной организации репаративного остеогенеза на
основе цитокиновой оптимизации.
Целью исследований явилось обоснование применения рекомбинантного
интерлейкина-2 человека с целью индукции репаративного остеогенеза в условиях
внешней фиксации костных отломков аппаратами стержневого типа на базе
клинико-рентгенологических и биохимических исследований.
Для достижения
поставленной цели решались следующие задачи:
1. На основании клинического мониторинга обосновывалось
остеоиндуцирующее влияние ронколейкина (генноинженерный аналог
эндогенного интерлейкина-2 человека) на процессы остеорепарации.
2. Изучались биохимические показатели крови при
индуцированном цитокином противовоспалительном остеогенезе.
Материал и методы. Исследования проводились
с 2004 по 2007 гг. на базе ветеринарного пункта СООО ЦРБ г. Саратов.
Экспериментальная работа выполнена на двадцати четырех
кроликах породы «серый великан» и «венский белый» в возрасте шести месяцев. По
принципу аналогов были сформированы две группы животных: первая группа –
опытная, вторая – контрольная, в каждой группе находилось по двенадцать животных.
Для проведения опыта моделировали флексионный перелом костей
голени, а через двое суток устанавливали аппараты внешней стержневой фиксации
со стальными (12Х18Н9Т) остеофиксаторами, имеющими термооксидное биопокрытие
[5].
Кроликам всех групп проводили превентивную
антибиотикотерапию, санацию остеофиксаторов, иммунокоррекцию. Последняя
заключалась во введении ронколейкина кроликам первой группы подкожно в дозе
20000 ЕД/кг живой массы на 1, 3, 5, 7-е сутки терапии.
Рентгенологическое исследование проводили на первые,
четырнадцатые и тридцатые сутки после установки аппарата внешней стержневой фиксации,
а также сразу после демонтажа конструкции. Использовался стандартный рентгенологический
аппарат РУМ-20-М-1. Выбор проекции и анализ рентгенологической информации
осуществляли в соответствии с классическими руководствами.
В движении исследовали вид хромоты и степень нагрузки
поврежденной конечности. Анатомо-функциональную оценку остеосинтеза проводили
по методике И.Б. Самошкина [4].
Исследование крови для определения биохимических показателей
крови проводили до и на 1, 10, 20,
30-е сутки после операции.
Общий белок сыворотки крови определяли биуретовым методом с
использованием фотоэлектроколориметра, для определения активности щелочной
фосфатазы использовался кинетический метод. Определение уровня содержания
общего кальция в сыворотке крови проводили комплексометрическим методом с
индикатором флюорексоном (по Вичеву и Каракашеву). Уровень ионизированного
кальция определяли расчетным методом по Тодорову. Неорганический фосфор определяли
в сыворотке крови по Коромыслову и Кудрявцевой.
Полученные результаты были обработаны известными методами на
компьютере Intеl Pеntium-4 с использованием программы Statistica 6. При этом вычислялись
средние арифметические показатели и погрешности исследуемых характеристик, а
также коэффициент достоверности показателей по отношению друг к другу.
Клинический
мониторинг форсированного остеогенеза у опытных животных
проводился ежедневно. Он включал термометрию, исследование пульса, частоты
дыхания, оценку общего состояния, биомеханическую оценку движений.
На контрольных рентгеновских снимках животных всех групп
через сутки после операции можно было видеть отломки, зафиксированные аппаратом
стержневого типа в правильном положении, с допустимым диастазом.
При дальнейшем исследовании в клиническом состоянии
экспериментальных животных отмечались изменения, в частности, на четырнадцатые
сутки после остеоклазии во всех группах кролики активно передвигались, принимали
корм и воду. У животных 1 группы отмечалось отсутствие признаков воспаления на
прооперированной конечности, в то время как у животных 2 группы в прооперированной
зоне проявлялась небольшая болезненность.
На рентгенограммах, выполненных через 14 суток после
установки аппарата внешней фиксации, наблюдалось различие организации костной
ткани в зависимости от проведенной терапии. В частности, у животных 1 группы отчетливо
просматривалась характерная для данного периода картина формирования костной
мозоли: незначительная размытая тень в зоне проксимального и дистального
отломков большой берцовой кости с сохранением полосы диастаза в месте перелома,
отсутствие периостальной реакции. На рентгенограммах кроликов 2 группы
периостальная реакция в участке остеоклазии явно просматривалась, размытая тень
в зоне нарушения целостности кости большой берцовой кости, с сохранением полосы
диастаза в месте перелома.
На рентгенограммах, выполненных через 30 суток после
осуществления остеосинтеза, явно просматривалась корреляция между качеством
формирования костной мозоли и проводимой специфической терапией. На снимках животных
1 группы наблюдалась однородно сформированная мозоль, место диастаза не
визуализировалось. У животных 2 группы на тридцатые сутки эксперимента костная
мозоль была в завершающей стадии формирования. В частности, прослеживалось
прерывание кортикальной пластинки, зона нарушения костной ткани
визуализировалась, поскольку регенерат имел различную плотность с прилежащими
материнскими отделами кости.
Таким образом,
клинические и рентгенологические изменения костей лабораторных животных в течение
эксперимента были связаны, с нашей точки зрения, со способом лечения. В
частности, позитивные изменения у кроликов 1 группы были обусловлены
иммуноспецифическими свойствами ронколейкина. Что привело к более раннему, в
отличие от контрольной группы, восстановлению трофики мягких и костной тканей,
наиболее качественной консолидации отломков, формированию полноценного
регенерата.
Динамика биохимических показателей крови кроликов на фоне оптимизации
репаративного остеогенеза. Дооперационный уровень макроэлементов в крови
не выходил за рамки физиологической нормы. Однако в первые сутки после
оперативного вмешательства в обеих группах животных наблюдалась гиперфосфатемия,
сопровождающаяся гиперкальциемией. В частности, уровень общего кальция в 1
группе достиг 2,72 ммоль/л (р<0,05),
неорганического фосфора – 1,14 ммоль/л, концентрация ионизированного кальция –
1,21 ммоль/л (р<0,05). В контрольной группе показатели общего кальция и
неорганического фосфора через сутки эксперимента составляла 2,74 ммоль/л и 1,16
ммоль/л соответственно, уровень ионизированной формы кальция также повышался.
Концентрация общего белка в 1 группе в этот период достоверно упала с 62,1 г/л
до 58,1 г/л (р<0,05), во 2 группе уровень общего белка понизился с 60,7 г/л
до 57,6 г/л (р<0,05). Активность щелочной фосфатазы в крови опытных животных
сразу после выполнения флексионного перелома находилась на верхней границе
нормы и составила в 1 группе 63 МЕ/л, в группе контроля 67 МЕ/л, что говорит о
том, что травма костной ткани еще не спровоцировала повышение маркера данной
патологии. При этом через сутки после проведения экстернального остеосинтеза
было установлено, что активность фосфатазы резко повысилась в обеих группах,
причем в 1 группе она увеличивалась до 78 МЕ/л (р<0,01), что являлось ее
пиком.
Через десять суток наблюдений тенденция изменилась, уровень
неорганического фосфора продолжал повышаться, достигая пика в 1 группе – 1,87
ммоль/л (р<0,01), концентрация общего и ионизированного кальция наоборот,
достоверно снизилась до 2,37 ммоль/л (р<0,01) и 0,98 ммоль/л (р<0,01)
соответственно. В контрольной группе на десятые сутки гиперфосфатемия достигла
величины 2,02 ммоль/л (р<0,05), что явилось самым высоким показателем во
всех группах за время проведения эксперимента. Уровень общего кальция во 2
группе снизился до 2,18 ммоль/л (р<0,01), а ионизированного – с 1,23 ммоль/л
(р<0,05) до 0,82 ммоль/л (р<0,01). В этот период во всех группах отмечалось
повышение концентрации общего белка, причем наиболее интенсивные изменения
происходили в группе контроля, достигая к десятым суткам эксперимента 71,0 г/л
(р<0,01). В 1 группе величина общего
белка к десятым суткам также возрастала до значения 63,20 г/л (р<0,05). В 1
группе происходило стабильное уменьшение активности щелочной фосфатазы,
достигая при этом значения 72 МЕ/л (р<0,05), а в группе контроля активность
постепенно возрастала до уровня 89 МЕ/л (р<0,01).
На двадцатые сутки эксперимента в 1 группе животных
наблюдалось повышение концентрации всех форм кальция, особенно его
ионизированной формы (с 0,98 ммоль/л до 1,01 ммоль/л). Концентрация общего
кальция в сыворотке крови незначительно увеличилась до 2,51 ммоль/л
(р<0,05), при достоверном снижении уровня неорганического фосфора до 1,23
моль/л (р<0,05). В контрольной группе было зафиксировано уменьшение
концентрации неорганического фосфора и возрастание обеих форм кальция. В 1
группе концентрация общего белка достигла пика на двадцатые сутки эксперимента
(66,7 г/л (р<0,05)), у кроликов группы контроля – уровень общего белка
достоверно снизился до 68,5 г/л (р<0,05). На двадцатые сутки после
остеосинтеза в 1 группе активность щелочной фосфатазы достигла 66 МЕ/л
(р<0,05), во 2 группе в этот период наблюдалось резкое уменьшение ее уровня
с 89 МЕ/л до 71 МЕ/л (р<0,01).
К концу эксперимента
(тридцатые сутки) снижение концентрации неорганического фосфора в 1 группе
продолжалось и достигло значения 1,07 ммоль/л (р<0,05). Постепенное
повышение концентрации общего кальция сопровождалось аналогичным приростом его
ионизированной формы до 2,52 ммоль/л и 1,06 ммоль/л соответственно. Количество
общего белка упало до 63,3 г/л (р<0,05), что соответствовало дооперационному
уровню. Активность щелочной фосфатазы составила 54 МЕ/л (р<0,01). В группе
контроля количество неорганического фосфора снизилось до 1,22 ммоль/л, а общего
кальция наоборот повысилось до 2,29 ммоль/л. Концентрация ионизированного
кальция продолжала возрастать, достигнув величины, равной 0,91 ммоль/л
(р<0,05). Количество общего белка находилось в пределах физиологической
нормы, при этом продолжалось снижение активности щелочной фосфатазы с 71 МЕ/л
до 65 МЕ/л (р<0,05).
Анализ наиболее информативных биохимических маркеров остеосинтеза показал позитивное влияние цитокиновой иммунокоррекции, заключающееся в раннем создании предпосылок к формированию костного регенерата в период протекания травматической болезни, что проявлялось нормализацией активности щелочной фосфатазы и понижением концентрации неорганического фосфора на двадцатые сутки эксперимента, а также повышением уровня содержания кальция к окончанию эксперимента.
На основании проведенных исследований можно сделать
следующие выводы:
1. При оценке клинико-рентгенологических данных доказана высокая терапевтическая эффективность использования рекомбинантного интерлейкина-2 человека при лечении животных с переломами трубчатых костей. Наряду с обеспечением стабильной жесткой фиксации на протяжении всего периода лечения данный метод позволяет сократить сроки консолидации отломков, в среднем, на семь суток.
2. Нормализация содержания основных макроэлементов (общий и
ионизированный кальций, неорганический фосфор) в крови кроликов первой группы в
более ранние сроки, по отношению к кроликам второй группы, а также интенсивное
снижение активности щелочной фосфатазы свидетельствуют о долгосрочной активации
остеобластов и ускоренной минерализации костного матрикса.
1. Анников, В.В. Анатомо-морфологические аспекты оптимизации репаративного остеогенеза трубчатых костей в условиях фнешней фиксации аппаратами стержневого типа [текст]: Дис. док. вет. наук/ В.В. Анников.- Саратов, 2006.- 278 с.
2. Слесаренко Н.А. Проблемы остеорепарации в ветеринарной травматологии [текст]/ Н.А. Слесаренко, И.Б. Самошкин. – М., 1996. – 104 с.
3. Ватников, Ю.А. Структура и функциональная организация репаративного остеогенеза у животных [текст]: Автореф. дис. док. вет. наук/Ю.А. Ватников. – 2004.- 38 с.
4. Самошкин И.Б., Слесаренко Н.А. Реконструктивно-восстановительная хирургия опорно-двигательного аппарата у собак [текст]/и.Б. Самошкин, Н.А. Слесаренко– М: 2008, 200 с.
5. Родионов И.В., Бутовский К.Г., Анников В.В., Хапрова Т.С., Фролова О.Н.
Биоинтеграционные качества термооксидных покрытий чрескостных стержневых
металлофиксаторов при клинических испытаниях // Наукоемкие технологии. №8. Т.9, 2008. С. 57-66.