Биологические науки/ 6. Микробиология

к.х.н. Таутова Е.Н., к.х.н. Хамитова А.С., Николаева М.И.

Кокшетауский государственный университет им. Ш. Уалиханова, Казахстан

Культивирование почвенных микроорганизмов родов Aspergillus и Penicillium – продуцентов антибиотиков

Огромная группа организмов, принадлежащих к грибам, образует большое число (более 1150) разнообразных антибиотических веществ, отдельные представители которых завоевали всеобщее признание в качестве лечебных средств. Основная же часть грибных антибиотиков не нашла еще практического применения главным образом в силу своей высокой токсичности.

После того как было установлено, что пенициллин обладает мощными лечебными свойствами, начались интенсивные поиски продуцентов этого антибиотика. В результате большого числа работ удалось установить, что пенициллин могут образовывать многие виды Penicillium (P. chrysogenum, P. brevicompactum, P. nigricans, P. turbatum, P. steckii, P. corylophilum), а также некоторые виды Aspergillus (Asp. flavus, Asp. flavipes. Asp. janus, Asp. nidulans и др.). Основными продуцентами пенициллина являются: P. chrysogenum и P. notatum. Они встречаются в почве и на различных органических субстратах. Макроскопически их колонии сходны. Они имеют зеленую окраску, и для них, как и для всех видов серии P. chrysogenum, характерно выделение на поверхности колонии эксудата желтого цвета и такого же пигмента в среду. Кроме того, оба эти вида вместе с пенициллином часто образуют эргостерол [1].

Очень большое значение имеют пенициллы из серии P. roqueforti. Они обитают в почве, но преобладают в группе сыров, характеризующихся «мраморностью» (сыры «Рокфор» (Франция), сыр «Горгонцола» из Северной Италии, сыр «Стилтош» из Англии и др.).

В почве и на различных субстратах (зерне, хлебе, промышленных товарах и т. п.) часто встречается P. expansum. Но особенно известен он как причина быстро развивающейся мягкой коричневой гнили яблок. Конидиеносцы этого вида также образуют коремии. Массы спор его, присутствующие в воздухе, могут вызывать аллергические заболевания.

 Некоторые виды коремиальных пенициллов приносят большой вред цветоводству (например, Р. corembiferum приносит вред луковицам тюльпанов в Голландии, гиацинтов и нарциссов в Дании; P. gladioli для луковиц гладиолусов).

Большое значение из коремиальных грибов имеют пенициллы из серии P. cyclopium. Они широко распространены в почве и на органических субстратах, часто выделяются с зерна и зерновых продуктов, с промышленных товаров в разных зонах земного шара и отличаются высокой и разнообразной активностью. P. cyclopium принадлежит к одним из самых сильных токсинообразователей в почве.

Почва является не только резервуаром, но и местообитанием грибов. В связи с изменением состава грибов, в зависимости от типа почвы, географического положения, состава фаз роста растительности и многих других факторов соответственно изменяется число видов грибов и активность образования ими антибиотиков в почве. Образование антибиотиков грибами, как и другими организмами, имеет эволюционно приспособленный характер и тесно связано с общими процессами метаболизма грибов в природе и при культивировании [2, 3].

Сравнительная характеристика представителей родов Aspergillus и Penicillium показывает нижеследующее.

Мицелий пенициллов в общих чертах не отличается от мицелия аспергиллов. Он бесцветный, многоклеточный, ветвящийся. Основное различие между этими двумя близкими родами заключается в строении конидиального аппарата. У пенициллов он более разнообразен и представляет собой в верхней части кисточку различной степени сложности (рисунок 1, 2 а). На основе строения кисточки и некоторых других признаков (морфологических и культуральных) в пределах рода установлены секции, подсекции и серии [2, 3].

Рисунок 1. Строение конидиеносцев у грибов родов Penicillium и Aspergillus:

1 – одномутовчатый; 2 – двухмутовчатый симметричный; 3 – асимметричный (Penicillium); 4 – конидиеносец с одним ярусом фиалид; 5 – с двумя ярусами фиалид (Aspergillus).

а

б

Рисунок 2. Конидиеносцы: а – пеницилл, б – аспергилл.

Самые простые конидиеносцы у пенициллов несут на верхнем конце только пучок фиалид, образующих цепочки конидий, развивающихся базипетально, как у аспергиллов. Такие конидиеносцы называют одномутовчатыми или моновертициллятными (секция Monoverticillata). Более сложная кисточка состоит из метул, т. е. более или менее длинных клеток, расположенных на вершине конидиеносца, а на каждой из них находится по пучку, или мутовке, фиалид. При этом метулы могут быть или в виде симметричного пучка, или в небольшом количестве и тогда одна из них как бы продолжает основную ось конидиеносца, а другие располагаются на нем не симметрично. В первом случае они называются симметричными (секция Biverticillata-symmetrica), во втором — асимметричными (секция Аsymmetrica). У немногих видов, как веточки, так и метулы могут быть расположены не в один «этаж», а в два, три и больше. Тогда кисточка оказывается как бы многоэтажной, или многомутовчатой (секция Polyverticillata). У некоторых видов конидиеносцы объединяются в пучки — коремии, особенно хорошо развитые в подсекции Asymmetrica-Fasciculata [2, 3]. Если в колонии коремии слабо выражены, то она имеет мучнистую или зернистую поверхность, чаще всего в краевой зоне.

У пенициллов существует та же закономерность, которая отмечена для аспергиллов, а именно: чем проще строение конидиеносного аппарата (кисточки), тем у большего числа видов обнаруживаются клейстотеции (чаще в секциях Monoverticillata и Biverticillata-Symmetrica). Чем сложнее кисточка, тем меньше в этой группе встречается видов с клейстотециями. Так, в подсекции Asymmetrica-Fasciculata, характеризующейся особенно мощными конидиеносцами, объединенными в коремии, нет ни одного вида с клейтотециями. Из этого можно заключить, что эволюция пенициллов шла в направлении усложнения конидиеносного аппарата, возрастающей продукции конидий и угасания полового размножения.

Для аспергиллов характерен поверхностный стелющийся рост, однако при достаточной аэрации и строгом соблюдении асептики они могут размножаться и в толще твердой и в глубине жидкой среды. При поверхностном росте возвышаются органы плодоношения — конидиеносцы, которые отходят от особых опорных клеток мицелия. Конидиеносцы представляют собой утолщенные неветвящиеся несептированные, сильно зернистые на вид гифы длиной до 2000 мкм и более. На концах конидиеносцев появляется перетяжка без перегородки, выделяющая «пузырек» будущей головки. Пузырек округляется, увеличивается до 400 мкм, на его поверхности вырастают радиально расположенные продолговатые одно- или двухрядные клетки — стеригмы. На свободных концах стеригм размещаются цепочками более мелкие клетки — конидии. Конидии — покоящиеся клетки, с минимальным содержанием воды, шаровидной или эллипсовидной формы, средним размером в поперечнике 4 мкм. Поверхность конидий — гладкая, бугристая или шиповатая, черная (откуда и название этого гриба niger) или коричневая с различными оттенками (рисунок 1, 2 б). Окраска конидий определяет цвет всей конидиеносящей поверхности. Число конидий на каждой головке достигает 10 тысяч.

Таким образом, в морфологии, онтогенезе и других особенностях аспергиллов и пенициллов имеется очень много общего, что позволяет предполагать их филогенетическую близость. Некоторые пенициллы из секции Monoverticillata имеют сильно расширенную верхушку конидиеносца, напоминающую вздутие конидиеносца аспергиллов, и, как аспергиллы, встречаются чаще в южных широтах.

В целях поднятия производительности антибиотической промышленности, кроме внедрения в практику глубинной ферментации, необходимо получение и использование для биосинтеза новых высокопроизводительных штаммов-продуцентов. Для их получения необходимо более глубоко изучать способы культивирования, факторы, влияющие на качество культивирования, разрабатывать лучшие питательные среды. Вследствие большой вариабельности микроорганизмов-продуцентов и быстрой утраты ими исходных свойств (особенно уровня антибиотической активности) необходимо разработать методы хранения микроорганизмов-продуцентов и поддержания активности, а также способы приготовления посевного материала для засева, как в лабораторных условиях, так и в огромных объемов питательной среды в ферментерах [1].

Для выполнения любого исследования, связанного с выращиванием микроорганизмов, необходимо приготовление питательной среды. Микроорганизмы, населяющие почву, различны по потребностям в источниках питания, поэтому универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех микроорганизмов, не существует. В данной работе использована среда Чапека. Объектами исследования данной работы были различные образцы почв. Посев почвенной суспензии проводился на поверхность агаризованной питательной среды на чашках Петри. Засев проводился каждого образца почвы (всего 6 проб) в четырех последовательных разведениях и в пяти вариантах (чашках) каждое. Инкубировали в термостате при температуре 25⁰С. Анализ проводился через 6 дней инкубации, затем повторно через 14 дней от начала опыта.

Как показал анализ проведенного эксперимента в 1-м почвенном образце – верхний слой почвы хвойного леса – наиболее распространены колонии родов Aspergillus и Penicillium с преобладанием первого (рисунок 2). Aspergillus растет отдельными колониями, размеры которых в среднем составляют около 20 – 30 мм (в диаметре). Колонии правильной округлой формы. Имеют очень «богатую» спороносящую часть. Колонии Penicillium более мелких размеров, чем колонии Aspergillus, имеют неправильную разнообразную форму (овальную, более вытянутую, с выростами) и имеют различную окраску (от бледно-желтой до насыщенной оранжевой). Во 2-м почвенном образце: нижний слой почвы хвойного леса – все колонии одного рода – Penicillium. Колонии практически одного размера, но имеют разнообразную форму, обратная сторона мицелия некоторых колоний желтоватого цвета.

3-й и 4-й опыты. Почвенные образцы: верхний и нижний слои почвы речного берега встречаются сплошные колонии родов Aspergillus и Penicillium, при этом наблюдается преобладание Aspergillus. 5-й и 6-й опыты. Почвенные образцы взяты у муравейника (верхний и нижний слои). Колонии микроорганизмов незначительные. Небольшого диаметра, изолированные и рассеяны по всему диаметру чашки Петри. В основном это Aspergillus. Колонии имеют очень бедную спороносящую часть.

На основании проведенных экспериментов можно сделать следующие выводы:

1. Исследованные почвы, относящиеся к разным биогеоценозам, отличаются по микробиологическим показателям.

2. В верхнем слое почвы наблюдается преобладание микроорганизмов рода Aspergillus, а в нижнем Penicillium. В некоторых случаях представители исследуемых родов присутствуют одновременно в одном варианте (чашке Петри).

3. Наиболее богат микробиологический состав почвы, взятой для анализа в хвойном лесу около сосны, а наиболее бедны по качественному и количественному микробиологическому содержанию образцы почвы, взятые вблизи муравейника.

Таким образом, несмотря на то, что прямые микроскопические методы позволяют выявить и учесть значительно большее количество микроорганизмов (число бактерий, учитываемых прямыми методами, в 1000 раз превышает то, которое учитывается методом посева), метод посева остается одним из распространенных в практике исследования почвенных микроорганизмов вследствие того, что позволяет учитывать групповой и в некоторых случаях видовой состав микроорганизмов. Из изолированных колоний, вырастающих на чашках, можно выделять микроорганизмы в чистые культуры для дальнейшего исследования и идентификации.

Литература:

1. Алмагамбетов К.Х. Биотехнология микроорганизмов. Астана, 2008. – 244 с.

2. Бабьева И. П., Зенова Г.М. Биология почв. М, 1989. – 336 с.

3. Методы почвенной микробиологии и биохимии. Под ред. Д.Г. Звягинцева. – М.: Изд-во МГУ, 1991. – 304 с.