Биологические науки/8. Физиология человека и животных
Хомутов
А.Е., Пурсанов К.А., Перепелюк З.В.
Нижегородская
государственная медицинская академия, Россия
Влияние гепарина на
нейротропную активность
даларгина
Даларгин (Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Ley-Arg) – оригинальный гексапептид, аналог лей-энкефалина,
синтезирован в Институте экспериментальной кардиологии ВКНЦ РАМН, является
регуляторным опиоидным пептидом, способным с высокой афинностью взаимодействовать
с δ-рецепторами и имеющим несколько меньшее сродство к μ-опиатным рецепторам
[1]. При прямой аппликации на структуры мозга
анальгетический потенциал даларгина сопоставим с таковым у морфина, однако при
внутривенном введении в терапевтических дозах, учитывая, что
гематоэнцефалический барьер практически непроницаем для веществ пептидной
природы, препарат уступает по анальгетической активности таким μ-опиатным
агонистам как FK-33824 и морфину.
При применении в клинике отмечено
антистрессорное действие даларгина (снижает уровень АКТГ, улучшает
микроциркуляцию при травматическом шоке), кардиопротекторное и цитопротекторное
свойства. По-мнению многих отечественных исследователей, даларгин обладает
корректирующими свойствами по отношению к эндогенным системам, направленными на
поддержание гомеостаза [2].
Целью исследования явилось изучение
влияния гепарина, протамин сульфата и налоксона на нейротропное действие
даларгина.
В качестве объекта исследования нами использовались
лабораторные мыши массой 20-25 г, самцы, содержащиеся в стандартных условиях
вивария. Нейротропное действие препаратов оценивалось с помощью теста «открытое
поле». «Открытое поле» представляет собой круглую арену диаметром 90 см с
пластиковым полом, расчерченную двумя концентрическими окружностями. Одна из
них отгораживает так называемый «центр» - место старта, вторая делит площадь на
две равные части; также арена расчерчена восемью диаметрами. Над ареной на
высоте 75 см размещается источник яркого освещения. При тестировании животное
помещали в центр арены и в течение 2 минут визуально оценивали: 1)
горизонтальную двигательную активность (количество пересеченных секторов); 2)
вертикальную активность (количество подъемов на задние лапки); 3) время ухода из центра на
периферию (латентный период); 4) количество возвратов с периферии в центр. Проводилось предварительное тестирование в течение 3 дней,
на четвертый день проводилось тестирование
через 15 минут после введения препаратов.
Данные, полученные в тесте «открытое поле»,
обрабатывались методами непараметрической статистики с помощью критерия Фридмана
и критерия Вилкоксона. При обработке данных применялся пакет статистических программ
SPSS 11.5 for Windows.
Контрольное внутрибрюшинное
введение физиологического раствора не оказывало достоверного влияния на
поведенческие показатели животных.
После введения даларгина в дозе 0.5 мг/кг
было выявлено повышение горизонтальной двигательной активности по сравнению с
днями предварительного тестирования (рис. 1), повышение вертикальной
активности, а также увеличение количества возвратов, по сравнению со всеми днями
предварительного тестирования. Даларгин
в дозе 1.0 и 3.0 мг/кг не проявлял никакого эффекта.
При тестировании после введения гепарина в
дозе 50 МЕ/кг выявлено достоверное повышение горизонтальной двигательной
активности (рис. 2), вертикальной активности, увеличение количества возвратов,
и снижение латентного периода, по сравнению со всеми днями предварительного
тестирования.
После
совместного введения даларгина (0.5 мг/кг) и гепарина (50
МЕ/кг) наблюдался совершенно аналогичный паттерн поведенческих эффектов -
достоверно повышается по сравнению со всеми днями предварительного тестирования
горизонтальная двигательная активность (рис. 3), вертикальная активность, а
также достоверно снижается латентный период, и увеличивается количество
возвратов.
Рис. 1. Влияние даларгина, гепарина, протамина и налоксона
на горизонтальную активность мышей
1. Физиол. р-р
(контроль);
2. Даларгин (0.5 мг/кг);
3. Гепарин (50
МЕ/кг);
4. Гепарин(50 МЕ/кг) → Даларгин (0.5 мг/кг);
5.
Протамин сульфат (10мг/кг) → Даларгин (0.5 мг/кг);
6. Налоксон (1.0мг/кг)
→ Даларгин (0.5 мг/кг).
*
- Различия между исходными и экспериментальными
данными
статистически значимы (р≤0.05)
В группах, получавших антагонист гепарина —
протаминсульфат (10 мг/кг) или совместно даларгин (0.5 мг/кг) и протаминсульфат, достоверных изменений в
горизонтальной двигательной активности выявлено не было, можно лишь отметить
тенденцию к понижению всех показателей при введении протаминсульфата. Кроме
того, в группе совместного введения протамина и даларгина достоверно
увеличилась вертикальная активность, т.е., при совместном введении даларгина и
протаминсульфата эффект даларгина заметно снижается. Возможно, на фоне блокады
эндогенного гепарина протаминсульфатом действие даларгина менее выражено.
При введении блокатора опиоидных рецепторов налоксона
(1.0 мг/кг) и совместного применения налоксона и даларгина (0.5 мг/кг) никаких достоверных изменений в поведении
также не наблюдалось, однако при инъекции налоксона наблюдалась тенденция к снижению
всех показателей. Следовательно, при совместном введении с даларгином, налоксон
блокировал все эффекты данного синтетического опиоида.
Рис. 2. Влияние даларгина, гепарина, протамина и
налоксона
на вертикальную активность мышей
1. Физиол. р-р
(контроль);
2. Даларгин (0.5 мг/кг);
3. Гепарин (50
МЕ/кг);
4. Гепарин(50 МЕ/кг) → Даларгин (0.5 мг/кг);
5.
Протамин сульфат (10мг/кг) → Даларгин (0.5 мг/кг);
6. Налоксон (1.0мг/кг)
→ Даларгин (0.5 мг/кг).
*
- Различия между исходными и экспериментальными
данными
статистически значимы (р≤0.05)
В целях корректного
анализа возможного влияния гепарина на проявление нейротропного действия
даларгина мы предварительно оценили собственное влияние гепарина на уровень
тревожности и исследовательской активности, поскольку ни в отечественной, ни в
зарубежной литературе не встретили ни одного указания на подобные исследования.
Было установлено, что введение гепарина в дозе 50 МЕ/кг также вызывало снижение
тревожности и увеличение исследовательской активности мышей, т. е. введение
гепарина сопровождается центральными эффектами.
Рис. 3. Влияние даларгина, гепарина, протамина и
налоксона
на количество возвратов с периферии
1. Физиол. р-р
(контроль);
2. Даларгин (0.5 мг/кг);
3. Гепарин (50
МЕ/кг);
4. Гепарин(50 МЕ/кг) → Даларгин (0.5 мг/кг);
5.
Протамин сульфат (10мг/кг) → Даларгин (0.5 мг/кг);
6. Налоксон (1.0мг/кг)
→ Даларгин (0.5 мг/кг).
*
- Различия между исходными и экспериментальными
данными
статистически значимы (р≤0.05)
Возможность
проникновения гепарина через ГЭБ была продемонстрирована рядом авторов [3] В
настоящее время показано, что гепарин в малых дозах способен трансформировать
реактивность ЦНС, его эффект при этом сходен с эффектами типичных психостимуляторов
[4]. Возможно, что действие гепарина опосредуется через гепаринсвязывающие
белки, максимальные колебания активности которых после стрессорного воздействия
были обнаружены в гиппокампе и стриатуме [5], т.е. в отделах лимбической системы,
ответственных за поведение. На мембранах
нейронов мозга имеется своеобразный HB-GAM-белок (Heparin-Binding
Growth-Associated Molecule), который связывает гепарин и гепарана сульфат и
участвует в росте нейритов перинатальных нейронов мозга in vitro [6]. Также
существует вероятность, что эффекты гепарина реализуются через опиоидные рецепторы
[4]. Авторы выявили позитивное влияние регулярно вводимых низких доз гепарина
(64 МЕ/кг) на обучаемость в тесте восьмилучевого радиального лабиринта и, обсуждая
возможный механизм обнаруженного феномена, указывают на полученные рядом
авторов свидетельства опиоидподобного действия гепарина. Полученные нами
результаты в опытах с блокадой поведенческих эффектов гепарина налоксоном также
позволяют предполагать подобное объяснение.
Введение даларгина на
фоне гепарина сопровождалось типичным для обоих паттерном поведенческих реакций
– повышение двигательной и исследовательской активности и т. д.
На основании
вышеизложенного можно предполагать, что нейротропные эффекты даларгина и
гепарина во многом однонаправлены и при совместном введении.
При введении
протаминсульфата, как и налоксона, никаких достоверных отличий от дней
предварительного тестирования не наблюдалось, но можно отметить тенденцию к понижению
всех показателей.
При совместном
введении даларгина и протамин сульфата эффект даларгина заметно снижается.
Возможно, на фоне блокады эндогенного гепарина протамин сульфатом действие
даларгина менее выражено.
Заключение. Подводя итоги проведённой серии экспериментов, можно
сделать вывод, что гепарин и даларгин, как при независимом, так и при совместном
введении снижают тревожность и увеличивают исследовательскую активность мышей,
следовательно, способны повысить устойчивость животных в ситуации,
провоцирующей повышенную тревожность.
Литература
1. Громова Е.А., Плакхинас Л.А., Митин Ю.В. Сравнительный анализ эффектов действия некоторых аналогов лей-энкефалина на исследовательское поведение животных. Физиологическое и клиническое значение регуляторных пептидов. Пущино; 1990.
2. Лишманов Ю. Б., Маслов Л.Н., Ласукова
Т. В. Роль опиоидной системы в адаптации организма и защите сердца при стрессе.
Успехи физиол. наук 1997; 1: 75 – 95.
3. Кудряшов Б. А. Ляпина Л. А., Азиева Л.
Д. Комплексное соединение гепарина с гистамином, его физико-химические и
биологические свойства Вопр. мед. химии 1990; 36 (4): 55 –57.
4. Кондашевская М.В., Кудрин В.С., Клодт П.М. Новые аспекты действия гепарина. Бюлл. экспер. биол. и медицины 2000; 130 (12): 613 – 616.
5. Белоусова, Т.В., Ушакова Г.А. Изменение
гепарин–связывающей активности белков мозга крыс после однократного воздействия
ионизирующего излучения в дозе 0,25 Гр. Радиационная биология. Радиоэкология 2002; 43 (3): 268-273.
6.
Kinnunen A., Kinnunen T., Kaksonen M.
N-syndecan and HB-GAM (heparin-binding growth-associated molecule)
associate with early axonal tracts in the rat brain. Eur. J. Neurosci. 1998; 10 (2): 635-648.