Химия и химические технологии/

6.Органическая химия.

К.х.н. 1 Валюк В.Ф., к.х.н. 2 Шилін С.В.

1Уманський державний педагогічний університет ім. Павла Тичини, природничо-географічний факультет, кафедра хімії та екології, 20300, Україна, Умань, вул. Садова 2, e-mail: Vvalyuk@mail.ru

2 Київський національний університет імені Тараса Шевченка, хімічний факультет, кафедра органічної хімії. 01033 Україна, Київ, вул. Володимирська, 64.

 

СИНТЕЗ ФЛУОРОГЕННИХ СУБСТРАТІВ ФЕРМЕНТІВ НА ОСНОВІ ПЕПТИДНИХ ПОХІДНИХ КУМАРИНІВ

 

Для вирішення величезного числа практичних та наукових задач у біохімії, клінічній діагностиці і промисловій ензимології, пов’язаних з вивченням ферментів, що прискорюють розщеплення білків, нуклеїнових кислот, полісахаридів, ліпідів та ін., – дуже широке розповсюдження одержали синтетичні субстрати і, зокрема, так звані флуорогенні субстрати, тобто похідні пептидів, при ферментативному розщепленні яких утворюються низькомолекулярні сполуки, що мають флуоресценцію [1-4].

Наприклад, для вивчення ферментів системи зсідання крові були запропоновані флуорогенні субстрати на основі 7-аміно-4-метилкумарину, максимум флуоресценції якого складає 460 нм (λзб.=380 нм). При цьому інтенсивність флуоресценції похідної кумарину, що утворюється, виявилася приблизно в 500 разів вище, ніж у вихідних метилкумаринамідних субстратів (МСА-субстратів) [5]. Ферментативну реакцію, яка відбувається, можливо представити схемою 1:

Схема 1

 

Синтез МСА-субстратів здійснювали шляхом взаємодії N-захищених амінокислот чи пептидів з 7-аміно-4-метилкумарином різноманітними методами пептидної хімії. Найчастіше для цього використовували дициклогексилкарбодиімід [5,6], метод змішаних ангідридів [7], хлорангідридний метод, а також ди-трет-бутилпірокарбонат, при застосуванні якого виходи МСА-субстратів досягали 70-85%. В роботі [8] для одержання МСА-похідних 6 використали мало розповсюджений метод активації аміногрупи кумарину за рахунок синтеза моноетилового естера фосфораміду 5 (схема 2). Цю сполуку вводили до реакції з такими Nα-бензилоксикарбоніл-L-амінокислотами, як Z-Arg-OH, Z-Ala-OH, Z-Phe-OH та Z-Glu(OBzl)-OH, що дало кумарини 6 з виходом 35-58%.

 

Схема 2

Для синтезу флуорогенних субстратів трипсину, хемотрипсину, тромбіну, еластази та інших ферментів замість 7-аміно-4-метилкумарину використовували також 7-аміно-4-трифторметилкумарин 7, або 4-метилумбелліферон 8 [9-10] і його похідні.

У роботі [11] розроблено ефективний твердофазний метод синтезу флуорогенних субстратів різних протеаз, що є похідними 7-аміно-4-карбомоілметилкумарину. Вихідний кумарин 11 було отримано за реакцією Пехмана з доступного 3-амінофенолу 9 через карбамат 10 при взаємодії з диетиловим естером 1,3-ацетондикарбонової кислоти (схема 3).

Схема 3

a: Етиловий естер хлоровугільної кислоти (0,5 екв.), AcOEt, кип’ятіння

b: 1,3-ацетондикарбонова кислота  (1,1 екв.), 70% H2SO4

c: 10 M NaOH, кип’ятіння

d: 1- TMS-Cl (2,1 екв.), 2- Pr2NЕt (2,1 екв.), 3- fmoc-Cl (1,1 екв.)

e: Смола Рінка, HOBt (1 екв.), DICI (1 екв.), ДМФА

Оскільки аміногрупа кумарину є слабким нуклеофілом, для нарощування поліпептидного ланцюга до бензопіранової системи 14  в реакції з fmoc-захищеними амінокислотами застосовували HATU в присутності 2,4,6-коллідину, що дає мінімальну рацемізацію (<1%). Цей метод дозволив  приєднати до 14  всі стандартні амінокислоти (окрім цистеїну) та синтезувати наступні пептиди: Ac-Lys-Glu-Trp-Lys-AСС (субстрат для плазміна) і Ac-Arg-Lys-Ser-Leu-Val-Nle-AСС (субстрат для ВІЛ-1 протеази). На основі 7-аміно-4-карбомоілкумарину, який є біфункціональною сполукою, в подальшому було розроблено високоефективний твердофазний метод синтезу пептидних субстратів, бібліотека яких включала понад 140000 пептидів. Ці сполуки використовували для скринінгу різноманітних протеїназ, що включали тромбін, плазмін, фактор Ха, активатор плазміногену урокіназного типу, тканинний активатор плазміногену, трипсин, хімотрипсин, еластазу нейтрофілів людини, папаїн та інші ферменти. АСС “пришивали” також до різних смол, які були функціоналізовані аміногрупою, і одержані продукти використовували для синтезу флуорогенних субстратів протеаз твердофазним методом, що привело до похідних 7-аміно-4-карбоимоілметилкумарину 15, що містить залишки двох амінокислот, та пептидилкумарину 16 [12].

Для твердофазного методу синтезу флуорогенних субстратів використовували смолу, що містила меркаптопропільну групу [13]. За рахунок утворення тіоефірного звязку до неї приєднували і нарощували пептид. Відщеплення утвореного пептиду від смоли  проводили реакцією аминолізу в присутності іонів срібла. При цьому тіоефірний зв’язок можна було розщепити різними амінами, у тому числі достатньо слабкими нуклеофілами, наприклад, ариламінами. Використовуючи 7-аміно-4-метилкумарин в якості ариламіну, вказаним методом було отримано, поряд з іншими сполуками, пептид 17 з виходом 75%. Рацемізація С-кінцевої амінокислоти склала при цьому менше 5%.

 

Автори статті [14] при розробці мікрометоду визначення на склі активності широкого кола різних ферментів: протеаз, фосфотаз, естераз і т.д., синтезували похідні 7-аміно- або 7-гідрокси-4-метилкумарину будови 18.

Було показано, що задля покращення імобілізації синтезованих похідних кумарину необхідно ввести на карбоксильному кінці замісника, який знаходиться у положенні 4, залишок гліцину в якості лінкера. В цій роботі було синтезовано субстрати каспаз (19а) та трипсину (19b). Для проведення реакції з відповідним ферментом бічні захисні групи (OBut і Boc)  спочатку видалялися після іммобілізації сполук 19а та 19b на склі.

Слід зазначити, що сполуки 19а і 19b є похідними, в структурі яких амінокислоти приєднані по двох різних положеннях: – по 7-аміногрупі (для взнавання ферментом) та по 4-карбоксиметильній групі (в якості лінкера).

Отже, наведені роботи, в яких розглядалися різноманітні аспекти хімії та біології кумаринів, свідчать про те, що бензопіранони є вельми перспективними речовинами, як в хімічному плані, так і для дизайну та синтезу нових біологічно активних сполук, які мають широкий спектр фізіологічної активності.

 

Література:

1.                 Mitchell G.A., Hudson P.M., Huseby R.M., et al., Fluorescent substrate assay for antithrombin III . // Thromb. Res. – 1978. – Vol. 12, № 2. – P. 219-225.

2.                 Claeson G., Aurell L. Small synthetic peptides with affinity for proteases in coagulation and fibrinolysis : An overview. // Ann. N.Y. Acad. Sci.- 1981.- vol. 370.- P. 798-811.

3.                  Fareed J., Messmore H.L., Walenga J.M., Bermes E.W.  Synthetic peptide substrates in hemostatic testing. // CRC Clin. Rev. Clin. Lab. Sci.- 1983.- vol. 19, № 2.- Р. 71-134.

4.                 Гершкович А.А., Кибирев В.К. Хромогенные и флуорогенные пептидные субстраты протеолитических ферментов. // Биоорган. химия.- 1988.- Т. 14, № 11.- С. 1461-1488.

5.                 Zimmerman M., Ashe B., Yurewicz  E.C., Patel G. Sensitive assays for trypsin, elastase, and chymotrypsin using new fluorogenic substrates. // Analyt. Biochem. – 1977.- Vol. 78, № 1.- P. 47-51.

6.                 Kanaoka Y., Takahashi T., Nakayama H., Tanizawa K. New fluorogenic substrates for subtilisin. // Chem. Pharm. Bull.- 1985- vol. 33, № 4.- P. 1721-1724.

7.                 Kanaoka Y., Takahashi T., Nakayama H., Ueno T., Sekine T. Synthesis of a new fluorogenic substrate for cystine aminopeptidase. // Chem. Pharm. Bull. – 1982.- Vol. 30, № 4. - P. 1485-1487.

8.                 Khammungkhune S., Sigler G. A convenient synthesis of benzyloxycarbonyl-L-amino acid 4-methylcoumaryl-7-amides. // Synthesis. – 1980. - № 8. - P. 614-615.

9.                 Del Nery E., Alves L.C., Melo R.L., Cesary M.H., Juliano L., Juliano M.A. Specificity of cathepsin B to fluorescent substrates containing benzyl side-chain-substituted amino asids at P1 subsite. // J. Protein Chem. – 2000.- Vol. 19, № 1. – P. 33-38.

10.            Kuromizu K., Shimokawa Y., Abe O., Izumiya N. New fluorogenic substrate for esterase activity of α-chymotrypsin and related enzymes. // Analyt. Biochem.- 1985.- vol. 151, № 2. - P. 534-539.

11.              Maly D.J., Leonetti F., Backes B.J., et al., Expedient solid-phase synthesis of fluorogenic protease substrates using the 7-amino-4-carbamoylmethylcoumarin (ACC) fluorophore. // J. Org. Chem.- 2002.- vol. 67, № 3.- P. 910-915.

12.              Zhu Q., Li D.B., Uttamchandani M., Yao S.Q. Facile synthesis of 7-amino-4-carbamoylmethylcoumarin (ACC)-containing solid supports and their corresponding fluorogenic protease substrates. // Bioorg. & Med. Chem. Lett.- 2003 - Vol. 13. - P. 1033-1036.

13.            Kaljuste K., Tam J.P. A novel on-resin synthesis of C-terminally amidated  peptides. // Tetrahedron Lett.- 1998.- vol. 39, № 51. -  P. 9327-9330.

14.            Zhu Q., Uttamchandani M., Li D., Lesaicherre M.L., Yao S. Q. Enzymatic profiling system in a small-molecule microarray. // Org. Lett. – 2003. - Vol. 5, № 8. - P. 1257-1260.