Д.А. Вульфова, Р.Ю. Ильяшенко, З.А. Сизова, Л.Л. Лукацкая, А.О. Дорошенко

Научно-исследовательский институт химии Харьковского национального

университета им. В.Н. Каразина. Украина, 61077, Харьков, пл. Свободы, 4

2-(5-[4-Диметиламинофенил]-2-оксазолил)-бензойная кислота как флуоресцентный сенсор для биологических объектов

Люминофоры, относящиеся к классу 2,5-диарилоксазола, обладают опти­чес­ки­ми свойствами, которые позволяют использовать их в различных научных и техно­логических целях. Они находят применение в синтезе пептидов [1], для установки флуоресцентных меток на биологические объекты [1]. Карбокси-замещенные диарилоксазолы, обладают биологической активностью [2], их используют в ка­честве противовоспалительных средств [3] и регуляторов роста растений [4].

Объектом исследования данной работы является 2-(5-[4-ди­ме­тил­амии­но­фе­нил]-2-оксазолил)-бензойная кислота, которая была синтезирована из фталевого ангидрида и дигидрохлорида ω-амино-4-диметиламино­ацетофенона с последую­щей циклодегидратацией в серной кислоте по схеме, аналогичной использованной в работе [5]:

Изучаемое соединение обладает высоким квантовым выходом в органических растворителях и низким в водных средах, что определяет перспективу его использования в качестве флуоресцентного зонда для биологических объектов. Нами проведено кислотно-основное титрование в диапазоне от 9 до 1,5 единиц pH в среде 50 % об. этанол-вода и обнаружено существование двух равновесий, описываемых константами рК1= 4,840,11 и рК2= 2,680,04.

Вероятно, константа рК1 соответствует диссоциации карбоксильной группы, т.к. она близка по значению к константе диссоциации бензойной кислоты (4,20), рК2 – протонированию атома азота диметиламиногруппы, т.к. происходит в более кислой среде и сопровождается коротковолновым смещением спектров поглощения. Протонирование атома азота оксазольного цикла обычно происходит в интервале высоких концентраций кислоты, который описывается функцией кислотности Гамета H0 (<-1) и не достигается в образцах биологической природы.

Следовательно, в физиологическом интервале pH (5,5) соединение IV будет присутствовать преимущественно в анионной форме. Это свойство должно способствовать более высокой растворимости в водной среде, а также более прочному связыванию IV с белками.

Рис. 1. (a) Спектр флуоресценции 10 % спиртового раствора соединения IV с концентрацией 2,5 · 10-5 моль/л; (b) титрование белка САБ исследуемым зондом.

Для проверки данного предположения мы провели титрование альбумина сыворотки крови быка (САБ) исследуемым зондом: к раствору белка концентрации 1·10-4 моль/л прибавляли различные объемы раствора соединения IV в 10 % водном этаноле (рис. 1, серия кривых b) в количествах не вызывающих изменение нативной конформации белка (не более 6 об. %). При переходе из водного раствора в среду биологического объекта, спектры флуоресценции соединения IV существенно изменяются (рис. 1). Поскольку белок САБ не имеет собственной флуоресценции в диапазоне 500 нм, а максимумы флуоресценции свободного зонда находятся при другой длине волны, можно утверждать, что в биологической среде в спектре флуоресценции будут представлены, главным образом, молекулы соединения IV, инкорпорированные в белковую глобулу.

При концентрации зонда, превышающей 2,5·10-5 моль/л наблюдается эффект насыщения при заполнении зондом всех потенциальных мест связывания в белковой глобуле. Константа связывания соединения IV с белком САБ была рассчитана по полученным экспериментальным данным в области низких концентраций зонда и составила 3∙104 л·моль-1 (коэффициент корреляции R = 0,9968). На основании значения константы было оценено изменение свободной энергии при переходе моля зонда из воды в белковую глобулу: ΔG = -RT lnKc = -4,6∙10-3T lgKc  (ккал/моль), которое составило для взаимодействия IV с САБ ~ -6,0 ккал/моль, что характерно для невысокого вклада электростатических взаимодействиями по сравнению с дисперсионными и гидрофобными взаимодействиями [6].

Литература

1. Prezhdo O., Lysova I., Distanov V., Prezhdo V. Synthesis and scintillating efficiencies of 2,5-diarylthiazoles with intramolecular hydrogen bond // Tetrahedron Letters. – 2004. – V. 45. – P. 5291-5294.

2. Sakakibara T., Kume T., Ohyabu T., Hase T. Aromatic carbonilation regio-controlled by oxazole rings. novel route to heterocycle-substituted o-benzoates // Chem. Pharm. Bull. - 1989. - V. 37, № 7.– P. 1694-1697.

3. Short F., Long L. Synthesis of 5-aryl-2-oxazolepropionic acid and analogs. anti-inflammatory agents // Journal of Heterocyclic Chemistry - 1969. - V. 6, № 5. – P. 707-712.

4. Liu K., Howe R. Photochemical synthesis of 2-(2-aryl-5 oxazolyl)benzoates // Organic Preparations and Procedures - 1983. - V. 15, № 4.– P. 265-268.

5. Дорошенко А.О., Верезубова А.А., Птягина Л.М. Синтез, спектральные свойства и структурная релаксация в возбужденном состоянии полно-оксадиазольных орто-аналогов РОРОР // Вестник Харьк. Нац. ун-та.- 2000.- № 477.- Химия. Вып. 5(28).- С.92-96.

6. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран.- М.: Наука, 1980.- 320 с.