ВЛИЯНИЕ ТИОЛОВЫХ РЕАГЕНТОВ НА СТРУКТУРНО-МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ СПЕРМОТОЗОИДОВ ХРЯКА

Сельское хозяйство

Мусабеков А.Т., Рустенов А.Р., Шапиев И.Ш.

Докторант (Ph.D) ЮКГУ., проф. ЮКГУ им. М Ауезова., проф. ВНИИГРЖ

ВЛИЯНИЕ ТИОЛОВЫХ РЕАГЕНТОВ НА

СТРУКТУРНО-МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ

СПЕРМОТОЗОИДОВ ХРЯКА

Аннотация

В статье исследовано позитивное влияние тиоловых реагентов на сперматозоиды. Установлено, что после криоконсервации унитол и мекаптоэтанол помогает сохраненить структуру акросом и активность лактатдегидрогеназ.

Summary

Thiol reagents have a positive effect on the structural and metabolic parameters of sperm. So, Unithiolum dithiothreitol and mercaptoethanol significantly reduced the damage Akros, increase activity laktatdegirogenazy, but reduce the activity of the enzyme cytochrome oxidase.

В некоторых работах приводятся данные об участии низкомолекулярных SH-групп в регуляции метаболических процессов в половых клетках. Так, H.Lardy и др.[1], изучая различия в характере метаболизма эякулированных и эпидимиальных половых клетках быка, установили, что слабое поглащение кислорода последними обусловлено наличием в них связанного «регулятора», который превращается в активную форму после эякуляции. Серосодержащий «регулятор», выделенный из щелочного гидролизата семенников хряка, увеличевал скорость дыхания и аэробного гликолиза половых клеток. Хранение эякулята при комнатной температуре сопровождается выделением «регулятора» в плазму эякулята, что дает основание предпологать его участие в старении половых клеток.

Последующими исследованиями было обнаружено, что усиление дыхания эпидимиальных половых клетках может быть вызвано такими тиоловыми соединениями, как цистиен, восстановленный глютатион, сульфат и сульфид (Zardy H.; Rosdel. Z; Salisbury Y.) [2,3,4]. На этом основании высказано предположение, метаболическим регулятором могут быть содержащиеся в эякуляте низкомолекулярные тиоловые соединения.

Для выяснения механизма действия тиоловых соединений на криоустойчивость сперматозоидов и определения направления для дальнейшего совершенствования технологии замораживания было исследовано влияние тиоловых реагентов на структурно-метаболические показатели.

Сперму замораживали в среде ГХЦЖКМ имеющий следующий состав: глюкоза–50,5; натрия цитрат трехзамещенный–2,78г; калия цитрат двухзамещенный–0,65г; хелатон-1,0г; мочевина-3,0г; вода дистиллированная– 1000 мл.

Оценивали сохранность акросом сперматозоидов, ферментов лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и цитохромоксидазы в гамет после замораживания на жидком азоте (-196⁰С) и оттаивания при комнатной температуре.

В ходе этих экспериментов, также определяли интенсивность дыхания сперматозоидов и состояние дыхательной цепи с помощью ферментных анализов. Как видно из таблицы 1, унитиол, дитиотреитол и меркаптоэтанол достоверно снижали долю сперматозоидов с поврежденной акросомой. Цистеин, восстановленный глутатион не состоянии защитить акросому сперматозоидов хряка от повреждающего действия при технологическом процессе замораживания-оттаивания.

Добавление в среду цнстеина и восстановленного глутатиона не оказывало защитного действия и на сохранность в сперматозоидах тиолового фермента лактатдегидрогеназы. Не отличалась активность лактатдегидрогеназы от контроля и в пробах замороженных с меркаптоэтанолом и дитиотреитолом (табл.2). Однако, унитиол достоверно увеличивал сохранность фермента по сравнению с контролем.

Исследование активности цитохромоксидазы измеряемой по времени развития окраски показало, что все изученные тиоловые препараты уменьшают активность данного фермента, участвующего в терминальном участке дыхательной цепи.

Таблица 1. Влияние тиоловых реагентов на сохранность акросом после

замораживания-оттаивания сперматозоидов

Тиоловые реагенты	Число поврежденных акросом, %
Тиоловые реагенты	М±m	lim	Р
ГХЦЖКМ (контроль)	28,43±3,12	9,63 – 37,45	-
ГХЦЖКМ + унитиол	20,19±2,98	12,87 – 27,58	0,01
ГХЦЖКМ + меркаптоэтанол	18,88±3,24	6,62 – 26,67	0,001
ГХЦЖКМ + цистеин	30,56±4,36	13,63 – 40,53	0,01
ГХЦЖКМ + восстановленный глутатион	30,27±4,65	12,85 – 40,34	0,05
ГХЦЖКМ + дитиотреитол	19,58±3,47	6,88 – 25,69	0,05

Наибольшее снижение активности, более 10 раз, наблюдалось в пробах замороженных с меркаптоэтанолом (табл. 2).

По-видимому такое ингибирования цитохромоксидазы связано с переключением дыхания преимущественно на аэробный гликолиз.

В контрольном опыте было установлено, что используемые в опытах тиоловые соединения обладают гипоксическим действием. Скорость поглощения кислорода из среды унитиолом и меркаптоэтанолом составляет 2-4 натомов О₂ /мин.

Другой причиной снижения активности цитохромоксидазы в пробах с меркаптоэтанолом является усиление свободного окисления не связанного с синтезом АТФ. что видно по низкой величине стимуляции дыхания с динитрофенолом (ДНФ). Об этом свидетельствует данные табл. 3, где

V_ДНФ / V_сукц=1.47 против 1.7 в контроле

Таблица 2. Активность лактатдегидрогеназы и цитохромоксидазы в

замореженно-оттаянной сперме с тиоловыми реагентами

Тиоловые реагенты	Активность лактатдегидрогеназыв мкМ пирувата на 10⁹сперматозоидов			Активность цитохромоксидазы, мин
Тиоловые реагенты	М	D±m_d	Р	М	D±m_d	Р
ГХЦЖКМ(контроль)	7,3	-	-	5,3	-	-
ГХЦЖКМ+ унитиол	7,8	0,4±0,01	0,01	17,2	9,7±1,8	0,01
ГХЦЖКМ+меркаптоэтанол	7,0	0,3±0,02	0,05	56,6	48,3±2,4	0,01
ГХЦЖКМ + цистеин	7,5	0,2±0,02	0,01	10,9	5,8±1,6	0,05
ГХЦЖКМ+ восстановленный глутатион	7,3	0,2±0,01	0,05	9,7	6,0±1,1	0,01
ГХЦЖКМ+дитиотреитол	7,5	0,3±0,02	0,01	12,4±14	19,7±1,6	0,05

D±m_d- разница между опытом и контролем

Таблица 3. Влияние тиоловых реагентов на показатели энергетического обмена в спермах хряков

на разных этапах замораживания

Тиоловые реагенты	Свежеразбавленная сперма			Сперма после эквилибрации			Замороженно-оттаянная сперма
Тиоловые реагенты	Vэнд	Vсц Vэнд	Vднф Vсц	Vэнд	Vсц Vэнд	Vднф Vсц	Vэнд	Vсц Vэнд	Vднф Vсц
ГХЦЖКМ (контроль)	78±6,3	1,12	2,87	93±12,3	1,28	2,88	75±13	1,22	1,75
ГХЦЖКМ+ унитиол	63±3,7	1,21	3,26	99±14,1	1,26	3,02	54±6,3	1,54	1,82
ГХЦЖКМ+ меркаптоэ-танол	77±6,8	1,17	3,41	99±15,6	1,07	2,67	64±12	1,52	1,45
ГХЦЖКМ+ цистеин	-	-	3,38	-	1,04	-	59±4,6	1,33	1,48
ГХЦЖКМ+ восстановлен-ный глутатион	-	-	3,29	-	1,01	-	57±8,5	1,31	1,43

Примечание:

V_энд- скорость эндогенного дыхания

V_сц- скорость дыхания с сукцинатом

V_днф- скорость дыхания с динитрофенолом

Доля свободного окисления в пробах спермы разбавленной средой содержащей меркаптоэтанол возрастает уже при охлаждении спермы до +4 ⁰С перед ее замораживанием. Величина стимуляции дыхания ДНФ после эквилибрации по сравнению со стимуляцией дыхания свжеразбавленных сперматозоидов падает от 3,40 до 2,70. В то же время унитиол оказал значительное защитное действие на сохранность сопряженности дыхания с фосфорилированием. Как видно из таблицы 8 величина стимуляции дыхания сперматозоидов с ДНФ - (УднФ/Усукц) в сперме разбавленной средой с унитиолом выше контроля и после эквилибрации 3,01 против 2,90 и после замораживания-оттаивания - 1.80 против 1,70.

Таким образом, исследования влияние тиоловых реагентов на структурно-метаболические показали, что унитиол, дитиотреитол и меркаптоэтанол достоверно снижает повреждение акросом сперматозоидов. Унитиол достоверно увеличивал активность лактатдегирогеназы, но все изученные тиоловые препараты уменьшают активность цитохромоксидазы, участвующего в терминальном участке дыхательной цепи. Причиной снижения активности цитохромоксидазы в пробах с меркаптоэтанолом является усиление свободного окисления не связанного с синтезом АТФ.

Литература

1. Lardy H. Chosh D. Plaut G. A metsbolic regulator in mammalian Spermatoza // Science. 1949. – v.109. P.365-374

2. Zardy H. Philips P. The effect of certain inhibitors andac activators on sperm metabolism // J. boil. Chem. 1941 – v. 138 P. 195-197

3. Rosdel Z. Contribution to mechanisms of sperm ripening in the epidiymis // Portpf. Zuchthyg. Haustrier-besam. – 1955. V.5. P.49-54

4. Salisbury Y. Reversal by Metabolic Regulators of CO₂–induced Inhibition of Mammalian Spermatoza // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. -1959. V.101. P. 187-189