Мусабеков А.Т., Рустенов А.Р., Шапиев И.Ш.

Докторант (Ph.D) ЮКГУ., проф. ЮКГУ им. М Ауезова., проф. ВНИИГРЖ

влияние низкомолекулярных тиолов на абсолютный показатель живучести и дегидрогеназную активность спермы хряков

 

Исследованиями C. Shearer [1] впервые было показано, что сперматозоиды очень богаты сульфгидрильными группами (SН-) и с тех пор этот факт неоднократно привлекает внимание исследователей. Установлено, что содержащаяся в сперме животных сера представлена в основном тиоловыми соединениями такими как цистеин, эрготионеин, окисленный и восстановленный глутатион. Среди низкомолекулярных тиоловых соединений, встречающихся в эякуляте, важную роль играет эрготионеин, выделенный из секрета пузырьковидных желез хряка. Об этом впервые высказано Leone E. и Mann T.[2]. Содержание эрготионеина в пузырьковидной железе хряков составляет в среднем 70 (19-256)  мг%, а в эякуляте -15-20мг%.

Одной из главных причин гибели сперматозоидов в процессе хранения in vitro, по мнению T. Mann [3], является окисление сульфгидрильных групп. Он считает, что низкомолекулярные SН-соединения в плазме спермы должны играть важную роль в предохранении от окисления ферментативных SН-групп.

Учитывая это, нами проведены изучения влияния низкомолекулярных тиолов (восстановленного глутатиона, цистеина, унитиола)  на подвижность, абсолютный показатель живучести (АПЖ) и дегидрогеназную активность спермы хряков. Определение качественных показателей эякулятов проведены в соответствии с «Инстукцией по технологии работы организацией по искусственному осеменению и трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных» [2000]. Содержание общих SН-групп определяли методом амперометрического титрования.

Восстановленный глутатион (Г-SН) является коферментом ряда ферментных систем организма. Кроме того он выполняет защитные функции, предохраняя белковые  SН-группы от окисления и блокирования различными ядами. Восстановленный глутатион использовали (табл.1) в концентра­циях от 6,5•10-4 до 3,3•10-2М. Г-SН в концентраци­ях 6,5•10-4 - 1,6•10-3 М почти не влияет на подвиж­ность и переживаемость сперматозоидов. По мере увеличения концентрации Г-SН переживаемость сперматозоидов за­метно снижается и при концентрациях, равных 2,6•10-2 - 3,3 •10-2М, движение сперматозоидов быстро прекраща­ется.

Таблица 1. Влияние восстановленного глутатиона АПЖ и дегидрогеназную активность сперматозоидов хряков

Концентрация Г – SН,

( М)

Срок хранения (час)

АПЖ

0

3

6

9

12

24

Активность дегидрогеназ  (мин)

ед.

%

Контроль(без реагента)

49

59

50

60

63

48

9,71

100,0

6,5· 10-4

45

51

47

54

71

65

9,47

97,4

1,6· 10-4

38

44

40

49

47

50

9,56

98,2

3,3· 10-3

30

29

34

44

48

55

8,51

87,3

1,6· 10-2

30

29

35

44

48

56

7,16

72,1

2,6· 10-2

28

32

30

31

32

40

0,77

8,4

3,3· 10-2

53

86

99

110

110

101

0,02

0,3

Активность дегидрогеназ (табл.2) повышается при использова­нии реагента в концентрациях 6,5•10-4 - 2,6•10-2М. При концентрации 1,6•10-2М активность дегидрогеназ увеличивается более чем в два раза по сравнению с конт­ролем. Повышение концентрации Г-SН до 3,3•10-2М приводит к снижению дегидрогеназной активности почти в 2 раза по сравнению с исходным уровнем.

Цистеин является  аминокислотой содержащий  сульфгидрильные группы. Цистеин широко используется для снятия торможения, вызванного тиоловыми ингибиторами.В опытах цистеин использовали (табл.3) в концент­рациях от 6,7  •10-6 до 1,7•10-1М. Низкие концентрации (6,7•10-6 - 6,7•10-5М) цистеина стабилизируют под­вижность и увеличивают переживаемость сперматозоидов на 15-21%, а высокие концентрации (6,7 • 10-1  - 1,7 • 10-1М) снижают их. 

Подвижность и переживаемость сперматозоидов падают параллельно с увеличением концент­рации реагента, в то время как активность дегидрогеназ при этом возрастает. Установлено, что высокие концентрации цистеина резко увеличивают активность дегидрогеназ цель­ной спермы. В специальном опыте было показано, что увели­чение активности дегидрогеназ в сперме происходит в основ­ном за счет активации дегидрогеназ плазмы. В серии опытов, проведенных на отмытых сперматозоидах, обнаружено, что 6,7•10-4М концентрация цистеина, почти не влияющая на переживаемость цельной спермы, увеличивает на 8% пе­реживаемость сперматозоидов, суспендированных в физиоло­гическом растворе.

Таблица 3. Влияние цистеина на абсолютный показатель живучести (АПЖ) и дегидрогеназную активность сперматозоидов хряков

Концентра-ция цистеина,

( М)

Срок хранения (час)

 

АПЖ

0

3

6

9

12

24

Активность дегидрогеназ  (мин)

ед.

%

Контроль   (без реагента)

54

67

67

76

90

67

9,01

100,0

6,7· 10-6

50

78

95

105

114

33

10,92

121,4

6,7· 10-5

46

75

95

102

103

36

10,21

113,8

6,7· 10-4

37

63

69

75

78

43

8,96

99,4

6,7· 10-3

9

15

20

26

34

36

2,11

23,6

6,7· 10-2

6

5

9

12

15

26

1,07

11,8

3,3· 10-2

6

8

7

8

9

14

0,59

6,5

5 · 10-2

5

5

5

5

6

6

0,37

4,1

3,3· 10-2

4

6

6

6

7

7

0,28

3,1

1,7· 10-2

4

7

7

7

7

7

0,12

1,4

В отмытых сперматозоидах после 3 часов инкубации с цистеином обнаружено более значительное уве­личение числа SН-групп, чем после инкубации с Г-SН. Это говорит о том, что цистеин лучше, чем Г-SН проникает через мембраны сперматозоидов.

Унитиол  (2,3-димеркаптопропан-сульфонат натрия), СН2 (SН) СН(SН) СН2SО3Nа · Н2О)-соединение широко употребляется в качестве антидота при отравлениях тяжелыми металлами. Лечение унитиолом основано на его способности вступать в реакцию с  тяжелыми металлами с образованием малотоксичных стабильных комплексов. По данным А.И. Черкес свободные SН-группы унитиола прочно связываются с ионами тяжелых металлов, освобождая SН-группы белков, в результате чего функциональная активность последних восстанавливается.

Действие унитиола на подвижность, абсолютный показатель живучести и дегирогеназную активность цельную сперму хряков приведены в таблице 4. Из данной таблицы  видно, что в широком диапазоне концентра­ций (от 6,7 •10-6 до 6,7•10-3М) унитиол значительно увеличивает переживаемость сперматозоидов.

Максимальное увеличение переживаемости получено при добавлении к сперме унитиола в концентрации 6,7 • 10-4 М. В этом слу­чае переживаемость сперматозоидов увеличилась на 176% по сравнению с контролем. Такое увеличение может иметь практическое значение при хранении спермы.

В соответствии с инструкцией по искусственному осемене­нию свиней для осеменения допускается сперма, содержащая не менее 60% поступательно-подвижных сперматозоидов. При добавлении к сперме оптимальной концентрации {6,7•10-4М) унитиола 60% сперматозоидов сохраняют поступательное движение более 18 часов, тогда как в контро­ле - только до 5 часов. Таким образом, время, в течение которого неразбавленная сперма хряков сохраняет пригод­ность для осеменения, увеличивается примерно в 3,5 раза.

Таблица 4. Влияние унитиола на АПЖ и дегидрогеназную активность неразбавленной спермы хряков

Концентрация унитиола, ( М)

Срок хранения (час)

 

АПЖ

0

6

12

24

48

72

Активность дегидрогеназ  (мин)

ед.

%

Контроль  (без реагента)

64

90

97

104

88

72

10,48

100,0

6,7· 10-6

66

89

84

80

114

119

11,46

109,3

6,7· 10-5

41

77

73

72

73

81

17,01

162,3

6,7· 10-4

39

58

55

53

53

61

28,97

276,4

1,7· 10-3

16

38

39

39

50

53

19

182,6

6,7· 10-3

7

11

18

25

34

39

14

126,2

1,7· 10-2

5

5

6

6

14

18

13,23

64,4

3,3 · 10-2

5

5

6

6

11

13

6,75

15,7

        Активность дегидрогеназ под действием унитиола повышается (таблица 4), за исключением концентрации 6,7 • 10-6 М. Специальный опыт показал, что унитиол в концентрации 1,3 • 10- 2 Ми выше вступает в реакцию с хлоридом тетразолия и вызывает появление окраски в отсутствии дегидро-геназ. Следовательно, увеличение активности дегидрогеназ в присутствии высоких концентраций унитиола трудно оце­нить количественно. В опытах на отмытых и ресуспендированных сперматозоидах установлено, что в этом случае макси­мальное положительное влияние унитиола проявляется в 6,7 • 10-5 М концентрации, т. е. в более низкой, чем в цель­ной сперме.

        Таким образом, нашими исследованиями установлено, что в определенных концентрациях низкомолекулярные тиоловые соединения положительно влияют на сохранность сперматозоидов в условиях in vitro. Так, восстановленный глутатион в концентрации 1,6•10-2М увеличивает активность дегидрогеназ более чем в 2 раза, цистеин достаточной степени проникает через мембраны сперматозоидов. Максимальное увеличение живучести сперматозоидов получено при добавлении к сперме унитиола в концентрации 6,7 • 10-4 М (176%) Такое увеличение может иметь практическое значение при хранении спермы в условиях in vitro и позволить получать большего потомства от генетически высокоценных производителей.

Литература

1.     Shearer C. On the oxidation processes of the echinoderm egg during fertisation // Pros. Rou Soc. London. Scries. -1922. V.22. №2  P.213-214

2.     Leone E. и Mann T. Ergothioneine in the seminal vesicle secretion. // Nature. -1951. –V.168. №8 –P. 205-214

3.     Mann T. The biochemistry of semen and of the male reproductive tract // N. Y.bernes a Noble. 1964. -  493 P.