Биологические науки/Физиология человека и животных

Валиуллина Ф.Ф., д.б.н. Ситдикова Г.Ф.

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Роль циклических нуклеотидов в реализации эффектов оксида азота (II) на секрецию медиатора из двигательного нервного окончания мыши

Оксид азота (II) (NO) обладает широким спектром биологического действия. Впервые NO стал рассматриваться в качестве регулятора физиологических процессов после исследований природы релаксирующего фактора, синтезируемого эндотелиоцитами сосудов. Впоследствии было показано, что NO является нейротрансмиттером и нейромодулятором во многих периферических и центральных синапсах, оказывая как ингибирующее, так и активирующее влияние на синаптическую передачу [1].

В периферической нервной системе было показано, что NO снижает вызванное выделение медиатора из двигательного нервного окончания лягушек как через цГМФ-зависимые, так и цГМФ-независимые механизмы [2]. При исследовании влияния NO на нервно-мышечную передачу у теплокровных животных получены противоречивые результаты. Целью данной работы было исследование эффектов NO на освобождение медиатора в нервно-мышечном синапсе мыши и выявление роли вторичных посредников (цАМФ и цГМФ) в реализации этих эффектов.

Эксперименты проводили на изолированных нервно-мышечных препаратах диафрагмы лабораторных белых мышей в условиях постоянной перфузии стандартным раствором Кребса. Для устранения сокращения мышц в раствор добавляли d-тубокурарин в концентрации 2-2.5 мкM. В экспериментах использовали фармакологические препараты фирмы Sigma, США. Для регистрации токов концевой пластинки (ТКП) использовали внеклеточный метод отведения с помощью стеклянных микроэлектродов. Электрод, заполненный раствором NaCl (2M), подводили к синаптической области, где на каждое раздражение регистрировали ТКП. Раздражение двигательного нерва производили прямоугольными электрическими импульсами сверхпороговой амплитуды длительностью 0.16 мс одиночными стимулами c частотой 0.2 имп/с. Накопление и усреднение сигналов производили при помощи персонального компьютера с использованием оригинальной программы «Elph» (автор программы – Захаров А.). Для статистической обработки полученных данных использовали параметрический t-критерий Стьюдента.

Для изучения эффектов оксида азота (II) мы использовали экзогенный донор NO – S-nitroso-N- acetylpenicillamine (SNAP) в концентрации 100 мкМ. Добавление SNAP в перфузируемый раствор приводило к снижению амплитуды ТКП, которая к 30 минуте составила 71,6±4,4% (n=14, p<0.05) относительно контроля (рис. 1 А). Субстрат синтеза NO (L-аргинин) в концентрации 100 мкМ уменьшал амплитуду ТКП до 65,2±6,8% (n=5, p<0,05) от контроля к 35 минуте аппликации (рис. 1 Б). Таким образом, субстрат синтеза NO оказывает такие же эффекты, как и донор, что указывает на эндогенный синтез газа в области нервно-мышечного синапса.

Известно, что действие NO в физиологических концентрациях связано с влиянием на гемовую группу растворимой формы гуанилатциклазы. Блокирование растворимой гуанилатциклазы производили с помощью селективного блокатора - 1H-[1,2,4]-oxadiazolo[4,3-a] quinoxalin-l-one (ODQ) в концентрации 2,5 мкМ. Для увеличения внутриклеточного уровня цГМФ и цАМФ мы использовали мембранопроникающие негидролизирующиеся аналоги - 8BrcGMP и 8(4CF)cAMP в концентрации 100 мкМ. В условиях блокирования гуанилатциклазы эффект SNAP не проявлялся, и к 30 минуте амплитуда ТКП составила 102,9±7,3% (n=6, p>0,05). На фоне действия 8BrcGMP эффект SNAP полностью сохранялся, амплитуда ТКП понизилась до 44,9±4,0% (n=6, p<0,05) по отношению к уровню секреции на фоне 8BrcGMP (рис. 1 Б). На фоне повышенной концентрации цАМФ аппликация SNAP не приводил к изменению амплитуды ТКП. К 30 минуте амплитуда ТКП составила 104,3±13,9% (n=4, p>0,05) (рис. 1-Б). Полученные данные свидетельствуют о том, что экзогенный и эндогенный NO угнетает секрецию медиатора в нервно-мышечном синапсе теплокровных животных посредством как цГМФ-зависимых, так и цАМФ-зависимых механизмов.

SNAP (100mkM)

Рисунок 1. Влияние и механизмы действия NO на вызванное освобождение медиатора в нервно-мышечном синапсе мыши.

А - Эффект экзогенного донора NO - SNAP в концентрации 100 мкМ на амплитуду ТКП.

Б - амплитуда ТКП при действии SNAP в контроле, субстрата синтеза NO - L-аргинина, SNAP на фоне действия ODQ, 8BrcGMP и 8(4CF)cAMP.

Литература:

1. Bredt , D.S. Nitric oxide,a novel neuronal messenger / D.S. Bredt , S.H. Snyder // Neuron. – 1992.-V. 8.№1. – Р.3-11.

2. Яковлев, А.В. Внутриклеточные пресинаптические механизмы эффектов оксида азота (II) в нервно-мышечном соединении лягушки / А.В. Яковлев, Г.Ф. Ситдикова, А.Л. Зефиров // Нейрохимия. – 2005. – Т. 22. №1. – С. 81-87.