Медицина / 2. Хирургия

Д.м.н. Лаврешин П.М., д.м.н. Афанасьев Е.Н., к.м.н. Гобеджишвили В.К., к.м.н Линченко В.И., Гобеджишвили В.В., Келасов И.Г., Калмыкова С.С.

Ставропольская государственная медицинская академия, Россия

Магноиммуносорбениная тест-система для диагностики развития спаечного процесса после абдоминальных операций

В течение последних десятилетий в медико-биологических исследованиях для избирательного концентрирования различных микроорганизмов и вирусов, их антигенов, иммуноглобулинов различных классов широко используется метод иммуномагнитной сепарации [2, 3].

Используя принципы получения композиционных органокремнеземных сорбентов [1], разработан аффинный магносорбент для диагностики аутоиммунного процесса при спайкообразовании в иммуноферментном анализе (ИФА). Для придания магносорбенту биоспецифических свойств и получения магноиммуносорбента на поверхность магносорбента иммобилизовали специфический лиганд, которым служил комплексный аутоантиген, полученных из спаек брюшной полости морских свинок. Иммобилизацию лиганда проводили следующим образом: к 0,4 мл 10 % взвеси МС добавляли 1 мл антигена с концентрацией белка 2,0 мг/мл, инкубировали 2 ч при значении рН раствора 6,0 – 7,0 и температуре от 22 до 37 ⁰С. Полученный сорбент использован для проведения иммуномагнитной сепарации специфических аутоантител в сыворотках крови животных со спаечным процессом в брюшной полости и детекции их в иммуноферментном анализе, при этом в качестве твердой фазы вместо полистироловых микропланшет, традиционно используемых при постановке ИФА, применяли разработанную нами тест-систему (ТС) при постановке «сэндвич»-варианта этого метода. Учет результатов проводили на регистрирующем фотометре ИФА-ОЭП (Россия) при длине волны 492 нм. Положительными считали пробы, если их оптическая плотность (ОП) в 1,5 и более раз превышала ОП отрицательного контроля.

Для оценки специфичности разработанной ТС были получены сыворотки морских свинок с антителами против различных здоровых органов животных. Для чего из печени, легкого, брюшины, рубцов морских свинок были изолированы водорастворимые антигенные комплексы, которыми иммунизировали животных путем 4-х кратных внутримышечных введений с интервалом в 5 дней. При контроле наличия специфических антител в реакции преципитации по Оухтерлони было показано наличие полос преципитации сыворотки при постановке иммуноферментного анализа с применением МИС для диагностики спаечного процесса. В остальных случаях были получены отрицательные или диагностически недостоверные результаты, что свидетельствовало о достаточной специфичности разработанной тест-системы. Эти опыты дали нам основание создать магноиммуносорбентную антигенную тест-систему для выявления предрасположенности к развитию внутрибрюшных спаек у человека. При этом в качестве лиганда, иммобилизуемого на поверхность магносорбента, использовали водорастворимый антигенный комплекс из внутрибрюшных спаек.

С целью изучения диагностических возможностей сконструированной нами ТС для прогнозирования предрасположенности к развитию послеоперационного адгезивного процесса, были исследованы сыворотки крови 48 больных, оперированных ранее по поводу острого аппендицита, у которых через 1,5 месяца и более при операциях по поводу другой патологии выявлены спайки в брюшной полости. Изучение сывороток этих пациентов в иммуноферментном анализе с ТС с антигенными комплексами, выделенными из нормальной брюшины, дали отрицательный результат в сроки от 30 до 60 суток. ТС с антигенными комплексами из внутрибрюшных спаек в те же сроки исследования с сыворотками крови изучаемой группы больных дали положительную реакцию в разведениях последней 1:80-1:640. На 30 сутки сыворотки крови всех исследуемых с внутрибрюшными спайками давали реакцию с ТС в разведении 1:80, а в разведении 1:160 лишь в 22 (45,8%) случаях, в разведении 1:320 – только у 8 (16,7%) пациентов. С 30 до 45 суток эта динамика изменялась: увеличивалось число пациентов, сыворотки которых давали положительную реакцию в титрах 1:160 и 1:320 - 26 (54,2%). У 6 (15,8%) больных реакция зафиксирована с титром сыворотки 1:640. Результаты иммуноферментного анализа сывороток больных с внутрибрюшными спайками к 60 суткам показывали тенденцию к нарастанию положительных реакций сывороток крови пациентов с ТС в разведениях 1:160 - 1:640.

Результаты иммуноферментного анализа сывороток 48 пациентов, сопоставимых по полу, возрасту, имевшейся патологии с предыдущей группой больных, у которых в брюшной полости спаек не образовалось (контрольная группа), были отрицательными. Лишь в единичных случаях (n=3) сыворотки реагировали в разведении 1:10 с МИС с иммобилизированными антигенными комплексами из спаек.

Разработанная ТС позволяет с высокой эффективностью прогнозировать развитие внутрибрюшных спаек. Появление и нарастание в сыворотке крови больных титра антител к спаечному аутоантигену в динамике исследования свидетельствует о развитии спаечного процесса в брюшной полости.

1. Афанасьев, Е.Н. Научно-методические аспекты экспресс-диагностики возбудителей особо опасных зоонозных инфекций (чума, бруцеллез, сибирская язва): Автореф. дис. … д-ра мед. наук: /Е.Н. Афанасьев. – Ростов-на-Дону, 2000. – 45с.

2. Grinde, B. Sensitive detection of group A rotaviruses by immunomagnetic separationand reverse transcription-polimerase chain / B. Grinde, T.O. Johanssen, H. Ushijima // J. Virol. Methods. - 1995. – vol. 55, № 3. - P. 327-38.

3. Recovery of Cryptosporidium oocysts and cysts from source water concentrates using immunomagnetic separation / R.M. McCuina, Z. Bukhari, J Sobrinhob et al. // J. Microbiol. Methods. - 2001. - vol. 45, № 2. - P. 69-76.