Биологические науки/6.
Микробиология
К.б.н. О. В. Топкова, к.б.н. В. А. Колодязная
ГОУ ВПО Санкт-Петербургская государственная
химико-фармацевтическая академия, Россия
Синтетическая среда для биосинтеза
неполиенового антибиотика имбрицина
В производстве
антибиотиков применяют исключительно комплексные питательные среды. Однако для
изучения особенностей метаболизма у микроорганизмов – продуцентов биологически
активных веществ и процессов, связанных с биогенезом, целесообразно
использовать синтетические среды определенного химического состава. Комплексные
среды, в состав которых входят сложные органические компоненты, такие как
кукурузная и соевая мука, кукурузный экстракт и тому подобные вещества, трудно
стандартизировать и повторять результаты эксперимента от опыта к опыту.
В настоящее
время нами проводятся исследования механизма сверхсинтеза неполиенового
противогрибкового антибиотика имбрицина под действием ауторегулятора,
образуемого продуцентом Streptomyces imbricatus [1,2]. Работы по изучению влияния
ауторегулятора на рост продуцента и синтез антибиотика необходимо проводить на
простых по составу питательных средах, исключающих использование каких-либо
сложных органических веществ. Кроме того, уровень антибиотикообразования на
синтетической среде должен быть близок к аналогичному показателю при
культивировании продуцента на комплексной среде.
Целью данной
работы явилось создание синтетической питательной среды, отвечающей
вышеперечисленным требованиям, для биосинтеза неполиенового противогрибкового
антибиотика имбрицина.
В работе
использовали продуцент неполиенового антибиотика имбрицина S. imbricatus ЛИА 0112/9М.
Для исследования зависимости образования
имбрицина от концентрации компонентов среды, отобранных на основе монофакторных
экспериментов, была составлена матрица планирования эксперимента по методу
ортогональных латинских прямоугольников [3] по схеме 8´4, включающая глюкозу, крахмал, аммоний сернокислый,
магий сернокислый, калия хлорид, натрий азотнокислый, цинк сернокислый, кальция
карбонат (мел) на разных уровнях. Эффект антибиотикообразования рассчитывали
для каждого фактора каждого уровня и определили их оптимальные значения
(табл.1).
Таблица 1
Зависимость эффектов
антибиотикообразования от концентрации компонентов питательной среды
Глюкоза |
% |
3,0 |
3,5 |
4,0 |
4,5 |
Эффект |
- 293 |
- 168 |
- 31 |
+207 |
|
Крахмал |
% |
4,0 |
4,5 |
5,0 |
5,5 |
Эффект |
- 156 |
- 37 |
+ 51 |
+ 143 |
|
(NH4)2SO4 |
% |
0 |
0,05 |
0,1 |
0,2 |
Эффект |
+ 27 |
+ 160 |
+ 89 |
- 276 |
|
MgSO4 |
% |
0 |
0,05 |
0,1 |
0,2 |
Эффект |
+ 80 |
- 28 |
- 52 |
- 68 |
|
KCl |
% |
0 |
0,2 |
0,4 |
0,6 |
Эффект |
- 159 |
- 138 |
+ 72 |
- 144 |
|
NaNO3 |
% |
0 |
0,1 |
0,2 |
0,3 |
Эффект |
+ 126 |
+14 |
- 58 |
- 123 |
|
ZnSO4 |
% |
0 |
0,01 |
0,025 |
0,05 |
Эффект |
+ 76 |
- 33 |
- 104 |
- 117 |
|
CaCO3
(мел) |
% |
0,4 |
0,6 |
0,8 |
1,0 |
Эффект |
- 109 |
+ 13 |
+ 108 |
+ 16 |
Анализ рассчитанных эффектов показал, что
5 факторов из 8-ми, а именно: глюкоза, крахмал, аммоний сернокислый, калий
хлористый и мел - были значимыми и влияли на выход имбрицина.
Вместе с тем, такие компоненты среды как
магний сернокислый, натрий азотнокислый и цинк сернокислый не оказывали влияния
на выход антибиотика, следовательно, их можно не включать в состав
разрабатываемой синтетической среды.
Зависимости «эффект-концентрация» для
аммония сернокислого, калия хлористого и мела носили ярко выраженный
параболический характер, что свидетельствовало о статистической достоверности
полученных данных.
Для таких факторов среды, как глюкоза и
крахмал оптимальными оказались самые высокие концентрации – 4,5 и 5,5 %
соответственно. Это свидетельствовало о том, что целесообразно проведение серии
опытов по уточнению оптимальных концентраций данных компонентов в подобранной
синтетической среде. Однако, после определения содержания редуцирующих веществ
на момент окончания ферментации (96 часов), убедились, что к этому времени
большое количество редуцирующих сахаров остается не утилизированным. В
культуральной жидкости в этот период ферментации общее количество редуцирующих
веществ было достаточно высоким и составляло 4,6 % против 12,4 % в исходной
среде. Следовательно, дальнейшее увеличение концентрации глюкозы и крахмала в
питательной среде нецелесообразно.
Таким образом, на основании проведенных
исследований предложена новая синтетическая среда для биосинтеза имбрицина
культурой S. imbricatus, на которой уровень антибиотикообразования составлял
1890±90 мкг/мл, что близко к
показателям активности на богатой комплексной среде (табл. 2).
Хорошо известно, что сверхсинтез
антибиотиков у многих актиномицетов зависит от наличия в питательной среде
фосфата. Многие продуценты очень чувствительны к содержанию в среде
неорганического фосфора. При избытке или недостатке неорганического фосфора
уменьшается синтез ряда антибиотиков, и изменяются морфологические и
физиологические особенности самого продуцента [4, 5]. В связи с этим были
проведены опыты по изучению влияния различных концентраций неорганического
фосфора на биосинтез имбрицина.
Таблица 2
Сравнение состава
синтетической и комплексной питательных сред
для биосинтеза имбрицина
Компоненты питательной
среды |
Содержание компонентов,
% |
|
Комплексная среда |
Синтетическая среда |
|
Соевая мука Кукурузная мука Глюкоза Крахмал CaCO3 (NH4)2SO4 KCl |
2,0 4,0 5,0 - - - - |
- - 4,5 5,5 0,8 0,05 0,4 |
Количество образующегося
имбрицина, мкг/мл |
2500 ± 125 |
1890 ± 90 |
Неорганический фосфор вносили в
питательную среду в виде 1 %-го раствора однозамещенного фосфата калия в
концентрациях от 0,01 до 0,1 %.
Полученные данные (табл. 3)
свидетельствуют, что культура S. imbricatus может осуществлять биосинтез антибиотика на
достаточно высоком уровне без внесения в питательную среду источника
неорганического фосфора.
Концентрация фосфора, колеблясь в широком
интервале от 2,28 до 22,8 мг%, не оказывает существенного влияния на уровень
антибиотикообразования. Можно сделать вывод, что продуцент имбрицина S. imbricatus
относится к ряду актиномицетов, малочувствительных к содержанию фосфора в
среде. К таким актиномицетам – продуцентам БАВ – относится, например, продуцент
олеандомицина S. antibioticus ОЛ-1,
для которого оптимальная концентрация фосфора в среде составляет 18-20 мг %, и
биосинтез лишь незначительно снижается при концентрации фосфора на уровне 40 мг
% .
Таблица 3
Влияние неорганического
фосфора на биосинтез имбрицина
Содержание в среде
однозамещенного фосфата калия, % |
Концентрация в среде
неорганического фосфора, мг % |
Количество образующегося
имбрицина, мкг/мл |
0 0,01 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 |
0 2,28 4,56 9,12 13,68 18,24 22,80 |
1890 ± 90 1820 ± 90 1830 ± 85 1820 ± 90 1870 ± 95 1750 ± 65 1640 ± 80 |
Литература
1.
Топкова, О. В. Изучение
биосинтез неполиенового антибиотика имбрицина на среде, содержащей фильтрат культуральной
жидкости продуцента / О. В. Топкова, Е.
П. Яковлева, Г. А. Яскович // Антибиотики и химиотерапия. – 2000. – Т.45, № 10.
– С. 5-9.
2.
Топкова, О. В. Выбор
способа выделения ауторегулятора из фильтрата культуральной жидкости Streptomyces imbricatus / О. В. Топкова и др. // Естественные и технические науки. – 2006. - № 3. – С.65-69.
3.
Бирюков, В. В. Основы
промышленной биотехнологии. – М. : КолосС, 2004. – 296 с.
4.
Gil, J.A., Campelo-Diez, A.B. Candicidin biosynthesis in Streptomyces
griseus // Appl. Microbiol. and Biotechnol. - 2003. - V.60, № 6. - P.633-642.
5.
Fjaervik, E., Zotchev, S.B. Biosynthesis of the polyene macrolide
antibiotic nystatin in Streptomyces noursei // Appl. Microbiol. and Biotechnol. - 2005. -V.67, № 4. -
Р.436-443.