УДК 619:616.155.392 (470.55/.57)

Полимеразная цепная реакция в диагностике лейкоза коров на южном урале

Оренбургский государственный аграрный университет

И. С. Пономарёва доцент, кандидат биологических наук

М .В .Сычёва зав.лабораторией, кандидат биологических наук,

М. А. Поляков старший преподаватель, кандидат ветеринарных наук,

О. П. Лысенкова научный сотрудник лаборатории кафедры микробиологии, Е.И.Афонина соискатель

В настоящее время лейкоз крупного рогатого скота занимает первое место в структуре инфекционной патологии крупного рогатого скота [4]. Например, в России доля лейкоза в структуре инфекционных заболеваний с 1994 по 2002 год возросла с 21,7 до 53%, а уже в 2006 году составила 62,7% [3]. Инфицированность животных в Оренбургской области порядка 30%. Поэтому представляются актуальными поиски решения эпизоотологических проблем в данной области, основывающихся на принципиально новых мировоззрениях и подходах.

Внедрение методов молекулярного анализа радикально расширило возможности изучения патогенеза инфекционных болезней и принципиально усовершенствовало диагностику. В этом плане полимеразная цепная реакция (ПЦР) становится всё более распространённым методом, который оптимально сочетает высокую чувствительность и специфичность. В основе метода ПЦР лежит природный процесс – достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимераза. Данный процесс можно использовать для получения копий коротких участков ДНК (ампликонов), специфичных для конкретных микроорганизмов. При многократном повторении циклов синтеза происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ДНК, что позволяет из небольшого количества анализируемого материала, который может содержать единичные клетки микроорганизмов, получить достаточное количество ДНК копий для их идентификации.

Цель настоящего исследования – оценка перспективности применения ПЦР для раннего выявления провируса лейкоза крупного рогатого скота при оздоровлении хозяйств Оренбуржья.

Материалы и методы: Для проведения мониторинговых исследований использовали годовые отчёты областного ветеринарного управления за период с 1991 по 2006 гг. Под опытом находились телки 4-5 месячного возраста, красной степной породы. Кровь отбирали из яремной вены, стабилизировали 10%-ным раствором трилона-Б. ДНК из крови животных выделяли сорбционным методом. Для проведения полимеразной цепной реакции использовали набор для диагностики лейкоза, Россия. Учёт реакции проводили в агарозном геле. Результаты обрабатывали статистически с использованием пакета программ Stat Plus2008 Professional.

Полученные результаты: Проведённые нами мониторинговые исследования инфицированности и заболеваемости крупного рогатого скота в области указывают на увеличение данных показателей. Так, если в 1991 г. инфицированность животных в стаде в среднем по области составляла 7,41%, то к 2006 году рассматриваемый показатель увеличился до 23,6% (33% у коров). Заболеваемость составила 1,9%, при вариабельности за исследуемый период от 1,36% до 2,6%. Корреляционный анализ указывает на наличие прямой положительной связи r=+0,99 между количеством инфицированных и больных коров. Вероятно, сложившаяся ситуация обусловлена передержкой инфицированных животных в стаде, несовершенством методов диагностики.

В Оренбургской области с начала восьмидесятых годов ветеринарными лабораториями проводились гематологические исследования проб крови. С момента введения серологических методов и до настоящего времени основным методом диагностики остаётся РИД, несмотря на то, что наблюдаются случаи «выпадения» положительной реакции и получения ложноположительных результатов. Это может быть следствием гиперактивности иммунной системы, спада титров антител и т.д. [1]. Однако РИД является самой простой в исполнении и не зависит от качества сыворотки. В то время как разрешающая способность тест-систем для ПЦР на два порядка и более превосходит прочие микробиологические и иммунологические методы.

Рис.1. Электрофореграмма продуктов ПЦР

1 - пробы без вирусоспецифической

последовательности;

2 – пробы содержат вирусоспецифи-

ческую последовательность;

3 – положительный контроль;

4 – отрицательный контроль;

5 – полосы внутреннего контроля.

Как показали наши исследования, применение ПЦР позволило обнаружить вирусспецифическую последовательность в ДНК лимфоцитов у 34,6% животных. На рисунке 1 представлена электрофореграмма продуктов ПЦР. В дорожках всех исследуемых проб имеется полоса внутреннего контроля на уровне 582 п.н. (ген альфа-актина крупного рогатого скота), в дорожках положительных контролей присутствуют специфические полосы на уровне

294 п.н., а отрицательных контролей – отсутствуют. Положительными являются образцы, имеющие специфическую светящуюся полосу на уровне 294

п.н.большей или меньшей интенсивности.

Гематологические исследования позволили обнаружить патологию только у 22,2% инфицированных тёлок. Исследование сыворотки крови реакцией иммунодиффузии показало, что РИД-позитивных животных было на 11,1% меньше, чем при исследовании методом ПЦР. Фактическое несоответствие результатов тестирования в РИД и ПЦР объяснимо целевыми возможностями, технической сущностью этих методов. В соответствии с существующими представлениями диагноз на лейкоз крупного рогатого скота устанавливается на основе РИД-позитивности у животных старше 6 месяцев. Именно к этому возрасту реальный инфекционный процесс достигает максимальной эффективности, результирующейся в интенсивном иммунном ответе и накоплении значительного количества антител, достаточных для выявления в условиях радиальной иммунодиффузии. РИД по своей сущности лишь качественная серологическая реакция, позволяющая осуществлять ретроспективную диагностику per se [2]. В то же время ПЦР как высокоразрешающий вариант прямой микробиологической диагностики весьма перспективна для таких целей. Таким образом, потенциальная возможность управления эпизоотическим процессом при лейкозе крупного рогатого скота, заключающаяся в своевременности выявления источника инфекции, возрастает в три раза.

Выводы:

1. Процент инфицированности крупного рогатого скота в Оренбургской области увеличился за изучаемый период в 4,4 раза, процент больных – в 1,9 раз.

2. Метод ПЦР для диагностики лейкоза коров позволяет выявлять инфицированных животных на ранних стадиях заболевания, это позволит существенно сократить сроки оздоровительных противолейкозных мероприятий.

Список литературы

1. Гулюкин М.И. Исключить крайности в проведении противоэпизоотических мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота / М.И. Гулюкин // Ветеринарный консультант. – 2005. - № 13-14. – С. 4 - 6.

2. Макаров В.В. ПЦР в диагностике лейкоза крупного рогатого скота / В.В. Макаров, Д.П. Гринишин // Ветеринария. - 2005. - №4. – С. 9-11.

3. Научно-техническая программа «неотложные меры профилактики и борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в племенных хозяйствах Российской Федерации». Ветеринарный консультант. №13. – 2003.

4. Смирнов А.М. О проблемах лейкоза крс / А.М. Смирнов // Ветеринарный консультант. – 2005. - № 13-14. – С. 3-4.