Биологические науки /9. Биохимия и биофизика

Д.т.н. Черно Н.К., к.х.н. Озолина С.А., Капустян А.И.

Одесская национальная академия пищевых технологий, Украина

Иммобилизация трипсина путем включения в

полиэлектролитные микрокапсулы

Одним из интенсивно развивающихся направлений современной биотехнологии является иммобилизация высокомолекулярных биологически активных веществ (БАВ) в нано- и микрообъекты, такие как липосомы, мицеллы, микро- и наночастицы [1-2].

Традиционные методы включения высокомолекулярных БАВ в микро-объекты фиксированного размера и формы (сферы, капсулы) основываются на физико-химических процессах преципитации, полимеризации, коацервации и др., которые предполагают использование органических растворителей, поверхностно-активных соединений, а также поперечно-сшивающих агентов. Это может сопровождаться снижением биологической активности иммобилизованной составляющей. Актуальной является разработка методов иммобилизации высокомолекулярных БАВ в микрообъекты в мягких условиях.

В 1998 году учеными Института коллоидной химии и химии поверхностей (Германия) был предложен новый тип полифункциональных микрокапсул, состоящих из ядра и оболочки, способ получения которых позволяет конструировать как внутренний объем, так и состав стенок, суть которого заключается в послойной (Layer-by-Layer) электростатической самосборке (Electrostatic Self-Assembly) противоположно заряженных полиэлектролитов на коллоидных частицах микронных и субмикронных размеров [3-5].

Для формирования микрокапсул используют в основном синтетические полиэлектролиты. Представляет интерес применение в качестве компонентов микрокапсул природных разноименно заряженных полимеров, обеспечивающих биосовместимость с активной составляющей а также биодеградируемость.

Целью исследования явилась оценка эффективности иммобилизации трипсина в микрокапсулы, сформированные методом послойной адсорбции биополимеров-полиэлектролитов на карбонатной матрице.

Карбонатные частицы получали путем совмещения эквимолярных растворов хлорида кальция и карбоната натрия. Включение трипсина в СаСО₃ микрочастицы проводили двумя методами: сорбцией и соосаждением [6]. В первом случае включение БАВ осуществляется в результате его физической сорбции на поверхности предварительно сформированной неорганической матрицы. В методе соосаждения формирование карбонатных микрочастиц происходит при взаимодействии хлорида кальция и карбоната натрия с одновременным включением в них фермента. Степень включения трипсина в состав нерастворимых карбонатных микрочастиц контролировали по изменению его концентрации в жидкой фазе.

Эффективность включения трипсина в первом случае составила 48 %, во втором – 81 % от его содержания в реакционной смеси, в связи с чем в дальнейшем иммобилизацию трипсина проводили методом соосаждения.

Карбонатные ядра с иммобилизованным ферментом поочередно инкубировали в растворах хитозана и пектина. Учитывая, что частицы карбоната натрия несут отрицательный заряд (ζ=-13 mV), первый наносимый слой формировали из хитозана (поликатион), следующий – из пектина (полианаион) и далее в такой же очередности.

Данную процедуру повторяли до образования необходимого количества слоев на поверхности неорганической матрицы. Далее карбонатную матрицу растворяли добавляя к полученным микрочастицам хелатирующий агент
(ЭДТА) – получили полые микрокапсулы.

Проницаемость полиэлектролитной мембраны микрокапсул регулировали варьируя концентрацию полисахаридов в интервале 0,1…1 %, молекулярную массу хитозана (32 и 240 кДа), а также изменяя число слоев хитозана и пектина от 2 до 8.

Результаты исследований показали, что наибольшая глубина расщепления субстрата иммобилизованным трипсином имела место при формировании
полиэлектролитной оболочки микрокапсул с использованием 0,3 % растворов полисахаридов. Увеличение их концентрации до 1,0 % приводило к образованию поверхностных структур практически полностью препятсвующих проявлению ферментом протеолитической активности. Такая зависимость была характерна для микрокапсул с двух- и четырехслойной полисахаридными оболочками. В связи с этим в дальнейших исследованиях оболочку капсул формировали используя 0,3 % растворы полисахаридов.

На рис. 1 представлены данные, характеризующие глубину гидролиза казеина иммобилизованным трипсином в зависимости от количества слоев полиэлектролитной мембраны (время инкубации 180 мин), которые свидетельствуют о том, что с увеличением числа слоев полиэлектролитной оболочки микрокапсул глубина гидролиза субстрата иммобилизованным ферментом умень-шается.

Рис. 1. Глубина гидролиза субстрата иммобилизованным трипсином в ПЭМК в зависимости от количества слоев полиэлектролитов

Так, глубина гидролиза казеина трипсином, включенным в восьмислойную мембрану, составляет 35…55 %; двухслойную – 70…95 %. При этом трипсин, иммобилизованный в полиэлектролитные микрокапсулы, сформированные с участием высокомолекулярного хитозана, расщепляет субстрат значительно медленнее, чем включенный в микрокапсулы, содержащие в качестве полиэлектролитной составляющей низкомолекулярный хитозан.

Для прогнозирования поведения иммобилизованного в полиэлектролитные микрокапсулы (ПЭМК) трипсина в пищеварительном тракте человека, исследовали влияние на его активность растворов, моделирующих жидкие среды желудочно-кишечного тракта. Гидролиз казеина свободным и иммобилизованным трипсином проводили при рН = 7 (кишечный сок) после предварительной инкубации фермента в среде, имитирующей желудочный сок.

Установлено что действие агрессивных сред желудочного сока (рН 1,35, пепсин) приводит к потере 95 % активности свободного трипсина и оказывает выраженное денатурирующее действие на фермент, иммобилизованный в составе ПЭМК с двухслойной полиэлектролитной мембраной (рис. 2).

Рис. 2. Глубина гидролиза субстрата иммобилизованным трипсином в зависимости от количества слоев полиэлектролитов (рН=7,5, время инкубации 180 мин)

Глубина гидролиза казеина трипсином, иммобилизованным в двухслойную микрокапсулу, содержащую низкомолекулярный хитозан, составила 34 %, высокомолекулярный – 50 %. При увеличении числа полиэлектролитных слоев в мембране до 4 глубина гидролиза субстрата иммобилизованным ферментом достигает своих максимальных значений: 85 % (низкомолекулярный хитозан) и 64 % (высокомолекулярный хитозан).

При дальнейшем увеличении числа слоев полисахаридов глубина расщепления казеина трипсином постепенно падает, что, вероятно, связано с уплотнением оболочки микрокапсул, затрудняющим взаимодействие фермента с субстратом.

Совокупность полученных данных свидетельствует об эффективности иммобилизации трипсина в ПЭМК, сформированные биосовместимыми и биодеградируемыми полимерами. Включение фермента в ПЭМК обеспечивает значительное сохранение их активности, стабилизацию и пролонгированное действие.

Литература:

1. Вудворд, Дж. Иммобилизованные клетки и ферменты [Текст] / Дж. Вудворд – М.: Мир, 1988, 215 с.

2. Каплун, А. П. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ [Текст] / А. П. Каплун, Шон Ле Банг, Ю. М. Краснопольский // Вопр. мед. химии. – 1999.– Т. 45. – №1. – С.3–13.

3. Trubetskoy, V. S. Layer-by-Layer deposition of oppositely charged polyelectrolytes on the surface of condensed DNA particles [Text] / V. S. Trubetskoy, J. E. Hangstrom, V. G. Budker, J. A. Wolff // Nucl. Acid Res. – 1999. – Vol. 27(15). – P. 3090–3095.

4. Sukhorukov, G. B. Microencapsulation by means of step-wise adsorbtion of polyelectrolytes [Text] / G. B. Sukhorukov, S. Moy, A. S Susha // Microencapsulation. – 2000. – Vol. 17(2). – P. 177–185.

5. Berth, G. Polyelectrolyte complex and layer-by-layer capsules from chitosan/chitosan sulfate [Text] / G. Berth, A. Voigt, H. Dautzenberg, E. Donath, H. Mohwald // Biomacromolecules. – 2002. – Vol. 3(3). – P. 579–590.

6. Включение белков в полиэлектролитные микрочастицы путем послойной адсорбции полиэлектролитов на агрегатах белка [Текст] / Д. В. Володькин, Н. Г. Балабушевич, Г. Б. Сухоруков, Н. И. Ларионова // Биохимия. – 2003.– Вып. 2(68). – С. 283–289.