УДК 619:616.98:579.873.21 Т – 07

Совершенствование микробиологической диагностики при туберкулёзе сельскохозяйственных животных

Светлана Владимировна Ионина, к.б.н., старший научный сотрудник, ioninasveta@gmail.com, тел. 8 (383) 308-77-41

Николай Александрович Донченко, д.в.н., заместитель директора по

научной работе, tbc2005@mail.ru, тел. 8 (383) 348-04-95

Валерия Николаевна Донченко, к.б.н., ведущий научный сотрудник,

тел. 8 (383) 348-02-29

Государственное научное учреждение Институт экспериментальной

ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии, vetinst@online.sinor.ru, тел. 8 (383) 348-44-62 (приёмная)

Приготовлена жидкая питательная среда для культивирования микобактерий туберкулеза с использованием органических и неорганических компонентов. Проведен сравнительный анализ роста различных штаммов микобактерий туберкулеза на контрольных и опытной жидких питательных средах. Представлена разработка способа посева микобактерий туберкулеза на жидкие питательные среды, используя столбики из мясопептонного агарового геля. Данный способ является удобным при посеве микобактерий на жидкие среды и позволяет получить обильную бактериальную массу в короткие сроки. Ключевые слова: питательные среды, культуры, микобактерии туберкулеза, штаммы, способ посева, культивирование микобактерий, первичный и интенсивный рост.

Perfection of microbiological diagnostics at a tuberculosis of agricultural animals

S.V. Ionina, N.A. Donchenko, V.N. Donchenko

Liquid nutritious environment for cultivation of micobacteria tuberculosis with use of organic and inorganic components is prepared. The comparative analysis of growth various strain of micobacteria tuberculosis on control and skilled liquid nutritious environments is carried out. The way of crop micobacteria of a tuberculosis on liquid nutritious environments is developed, using styles from meatextract agar. The given way is convenient at crop micobacteria on liquid environments and allows to receive plentiful bacterials weight in short terms. Key words: nutrient mediums, cultures, mycobacterium a tuberculosis, strian, way of crops, cultivacion mycobacterium, primary and intensiv growth.

Для ликвидации туберкулёза сельскохозяйственных животных и предотвращения распространения данного заболевания необходимо проведение специальных мероприятий, одним из звеньев которых является своевременное выявление возбудителя туберкулеза при помощи проведения микробиологической диагностики. Методической основой данного исследования, способствующего изоляция культуры микобактерий, являются различные методы, одним из которых, является культуральный метод. Основное накопление культур осуществляется в процессе культивирования их на питательных средах, количество и состав которых в настоящее время достаточно велико и разнообразно. Оптимальные условия для накопления бактериальной массы микобактерий создаются в основном в жидких питательных средах [1,2,3,4]. Степень активности микробной популяции зависит от качества питательной среды, следовательно, усовершенствование состава сред позволит получить ускоренный рост колоний микроорганизмов, при котором они сохранят свои основные свойства, так как сам процесс культивирования базируется на физиологических особенностях бактериальной клетки. Бактериальная масса формируется на поверхности жидкой среды, поэтому необходимо создать условия для того, чтобы культура микобактерий находилась на ее поверхности как можно дольше, вследствие этого, при культивировании микобактерий туберкулёза, важное значение имеют также способы посева микобактерий на среды. Существует достаточное количество указанных способов, но их недостатками является техническая сложность. В связи с вышеуказанным вопрос о стимулирующем влиянии различных веществ на рост микобактерий туберкулеза при посеве их на жидкие питательные среды актуален в настоящее время и требует детального изучения, как и разработка оптимальных способов посева культур микобактерий, способствующих их обильному росту с сохранением при этом их основных генетических свойств [5].

Материалы и методы. В 2001-2005 гг в лаборатории туберкулеза сельскохозяйственных животных ГНУ ИЭВС и ДВ СО Россельхозакадемии была проведена работа по разработке новой жидкой питательной среды для культивирования штаммов микобактерий туберкулеза и разработке нового способа посева микобактерий на поверхность жидких питательных сред.

Для усовершенствования состава среды в нее вносили минерально-солевую основу, которая представляла собой вытяжку из золы древесины березы 1,5%-ной концентрации, биостимулятор роста – криалл и сыворотку крови лошадей. Вытяжка содержала в своем составе все необходимые для жизнедеятельности микобактерий туберкулеза микроэлементы, а криалл представлял собой комплекс из макроэлементов и гуматов – стимуляторов роста микроорганизмов растительного происхождения. Аналогом для изготовления данной среды служила жидкая питательная среда Сотона. Спектральный анализ вытяжки проводили в лаборатории биохимии СибНИПТИЖа СО Россельхозакадемии. Криалл и сыворотку крови лошадей вносили в состав среды по 1 г и 1 мл на 100 мл вытяжки из золы древесины березы соответственно. В процессе приготовления сред проверяли совместимость компонентов и их растворимость в дистиллированной воде. Среду готовили в соответствии с «Методическими рекомендациями по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов». В качестве контроля использовали жидкие среды Сотона и Моделя.

При сравнении различных способов посева штаммов микобактерий туберкулеза, исследовали такие методы, как использование парафиновых пластинок, нанесение колоний микобактерий на стенку пробирки и столбиков, приготовленных из мясопептонного агарового геля, содержащего в своем составе глюкозу и глицерин. Введение в состав столбиков из мясопептонного агарового геля глюкозы и глицерина было обусловлено тем, что глюкоза и глицерин являются источниками углеводов, необходимых для активного роста и питания возбудителя туберкулеза. Глюкозу и глицерин вводили в состав столбиков в соотношении 1,0-1,2 г глюкозы и 2,0-2,2 г глицерина на 100 г мясопептонного агарового геля. Приведенное соотношение этих ингредиентов в составе мясопептонного агарового геля было отработано в результате проведенных многочисленных исследований.

Приготовление столбиков из мясопептонного агарового геля производили следующим образом: расплавленный и профильтрованный мясопептонный агаровый гель разливали в стерильные стаканы по 250 мл, вносили дополнительные компоненты - глюкозу и глицерин - и специальным стерильным цилиндром вырезали столбики высотой 8,0 - 8,2 см и диаметром 1,0 – 1,2 см с последующим помещением их в пробирки с жидкой средой так, чтобы поверхность столбика была выше уровня среды на 2-3 мм.

Посев культур осуществляли путем внесения в пробирки со средами Сотона, Моделя и вышеуказанной жидкой средой, апробированной и разработанной в лаборатории туберкулеза сельскохозяйственных животных пленки бактериальной массы по одной петле диаметром 1-3 мм, около 1 мг в фазе логарифмического роста.

Для посева были подготовлены эталонные трехнедельные штаммы следующих культур микобактерий: M.bovis (шт. 8, ВИЭВ), M.tuberculosis (шт.Н37Rv), М.smegmatis (культура ГНУ ИЭВСиДВ) и М.avium (шт.780, ВИЭВ).

Цель исследований – разработать новую эффективную жидкую питательную среду для культивирования микобактерий туберкулёза и новый способ посева микобактерий на поверхность жидких питательных сред.

Результаты исследований. Использование вытяжки из золы древесины березы для создания жидкой питательной среды для культивирования микобактерий, было обусловлено тем, что при проведении спектрального анализа вытяжки установлено, что в ее состав входят микроэлементы, необходимые для питания микобактерий в искусственных условиях, а оптимальной концентрацией при этом является концентрация 1,5%. Результаты спектрального анализа вытяжки из золы древесины березы представлены в таблице 1.

Таблица 1

Спектральный анализ вытяжки из золы древесины березы

Концентрация	Макро- и микроэлементы, мг/л
	калий	натрий	магний	железо	марганец	медь	цинк
1,5%-ная вытяжка золы	600±0,97	45±1,03	Следы	0,01	Следы	Следы	Следы

Проведенные многочисленные исследования по разработке состава жидкой питательной среды (всего было изготовлено 24 варианта), позволили нам сконструировать вариант, который был определен как окончательный.

При определении диагностической информативности сконструированной жидкой питательной среды и контрольных жидких питательных сред Сотона и Моделя, были получены следующие данные: появление роста патогенных штаммов микобактерий туберкулеза (M.bovis (шт. 8, ВИЭВ) и M.tuberculosis (шт.Н37Rv)) на изготовленной среде происходит на 10-е и 8-е сутки, на контрольных – на 16-е и 14-е соответственно; интенсивный рост появляется на опытной среде на 16-е и 14-е сутки, на контрольных – на 20-22-е сутки. Первичный рост штаммов М.smegmatis (культура ГНУ ИЭВСиДВ) и М.avium (шт.780, ВИЭВ) отмечали на опытной среде на 2-е и 11-е сутки, на контрольных средах – на 2-14-е сутки; интенсивный рост на опытной среде появился на 2-е и 18-е сутки, на контрольных – на 2-20-е сутки.

Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2

- Скорость роста различных штаммов микобактерий

туберкулеза на жидких питательных средах

Штаммы микобактерий	Питательные среды
	Сотона		Моделя		Опытная среда
Рост (сутки)
M.bovis (шт. 8, ВИЭВ)	первич	интенсив	первич	интенсив	первич	интенсив
	16	22	16	22	10	16
M.tuberculosis (шт H37Rv)	14	20	14	22	8	14
М.avium (шт.780, ВИЭВ)	12	20	14	20	11	18
М.smegmatis (культура ГНУ ИЭВСиДВ)	2	2	2	2	2	2

В результате проверки информативности различных способов посева штаммов микобактерий туберкулеза на жидкие питательные среды были получены следующие результаты: появление роста M.bovis (шт.8, ВИЭВ) при посеве на стенку пробирки отмечено на 18-е сутки, M.tuberculosis (шт.Н37Rv) – на 14-е сутки, М.avium (шт.780, ВИЭВ) – на 12-е сутки. Интенсивный рост M.bovis (шт.8, ВИЭВ), M.tuberculosis (шт.Н37Rv) и М.avium (шт.780, ВИЭВ) появился на 20 – 22 сутки. Рост М.smegmatis (культура ИЭВС и ДВ) как первичный, так и интенсивный при данном способе посева появлялся на 2-е сутки.

При посеве на парафиновую пластинку первичный рост M.bovis (шт.8, ВИЭВ) появился на 17-е сутки, M.tuberculosis (шт.Н37Rv) и М.avium (шт.780, ВИЭВ) – 12-е сутки. Интенсивный рост M.bovis (шт.8, ВИЭВ) отмечен на 21-е сутки, M.tuberculosis (шт.Н37Rv) – на 19-е сутки и М.avium (шт.780, ВИЭВ) – на 18-е сутки. Рост М.smegmatis (культура ИЭВС и ДВ) как первичный, так и интенсивный при данном способе посева появлялся на 2-е сутки.

При посеве использованных культур на столбики из мясопептонного агарового геля с добавлением глюкозы и глицерина отмечено, что первичный рост M.bovis (шт.8, ВИЭВ) при данном способе посева появился на 15-е сутки, рост M.tuberculosis (шт.Н37Rv) – на 8-е сутки и рост М.avium (шт.780, ВИЭВ) - на 6-е сутки. Интенсивный рост культуры M.bovis (шт.8, ВИЭВ) появился на 20-е сутки, M.tuberculosis (шт.Н37Rv) – на 14-е сутки и М.avium (шт.780, ВИЭВ) - на 16-е сутки. Рост М.smegmatis (культура ИЭВС и ДВ) как первичный, так и интенсивный при указанном способе посева отмечали на 2-е сутки (см. таблицу 3).

Таблица 3

Сроки появления роста штаммов M.bovis (шт. 8, ВИЭВ),

M.tuberculosis (шт.Н37Rv), М.smegmatis (культура ГНУ ИЭВСиДВ)

и М.avium (шт.780, ВИЭВ) при использовании различных

способов их посева

Культуры микобактерий	Способ посева
	Посев микобактерий на стенку пробирки		Посев микобактерий на парафиновую пластинку		Посев микобактерий на столбики из мясопептонного агарового геля
	появлен	интенс	появлен	интенс	появлен	интенс
M. bovis (шт.8, ВИЭВ)	18	22	17	21	15	20
M. tuberculosis (шт.H37Rv)	14	20	12	19	8	14
M. avium (шт. 780,ВИЭВ)	12	20	12	18	6	16
M. smegmatis (культура ГНУ ИЭВСиДВ)	2	2	2	2	2	2

Заключение. 1. Изучение диагностической информативности опытной жидкой питательной среды показало, что сроки появления первичного и интенсивного роста патогенных штаммов M.bovis (шт. 8, ВИЭВ) и M.tuberculosis (шт.Н37Rv) на опытной среде появляются на 5-8 суток быстрее, чем на контрольных средах, тогда как сроки роста штаммов М.smegmatis (культура ГНУ ИЭВСиДВ) и М.avium (шт.780, ВИЭВ) на контрольных и опытной среде совпадали по срокам их появления. Следовательно, сконструированная жидкая питательная среда является наиболее эффективной для роста патогенных штаммов микобактерий туберкулеза (патент РФ «Жидкая питательная среда для культивирования патогенных штаммов микобактерий туберкулеза» № 2300559 от 10 июня 2007года).

2. Новый способ посева культур микобактерий туберкулеза на поверхность столбиков из мясопептонного агарового геля даёт максимальное накопление бактериальной массы культур микобактерий туберкулеза (патент РФ «Мясопептонный агаровый гель для культивирования микобактерий туберкулеза» № 2339691 от 27 ноября 2008 года).

ЛИТЕРАТУРА

1. Голышевская В.И. Совершенствование методов микробиологической диагностики туберкулеза /Фадеева Н.И. // Сб. науч. тр. ЦНИИ туберкулеза. – 1987. – Т. 45. – С. 77 – 82.

2. Данко Ю.Ю. Оценка результатов бактериологических исследований при туберкулезе крупного рогатого скота / Современные проблемы профилактики и терапии заразных болезней сельскохозяйственных животных и птиц: Сб. науч. тр. – Ленинград, 1984. – Т. 80. – С. 24 – 27.

3. Диагностика и профилактика инфекционных болезней сельскохозяйственных животных //Сб. науч. тр. Воронежский сельскохозяйственный институт - Воронеж, 1990, - С. 35 – 38.

4. Иерусалимский Н.Д. Азотистое и витаминное питание микроорганизмов. М.: Издательство АН СССР, 1949. – 167 с.

5. Коромыслов Г.Ф. Итоги и задачи научных исследований по инфекционной патологии животных / Актуальные проблемы ветеринарной медицины в России: Сб. науч. тр., посвящ. 100-летию науки в России и 30-летию СО РАСХН. – Новосибирск, 1998. – С. 18-26.