Биологические науки / 6.Микробиология.

¹Маховська Ю. А., ²Воронкова О. С., ²Вінніков А. І.

¹Покровська центральна районна лікарня, ²Дніпропетровський національний університет ім. Олеся Гончара

Властивості ізолятів стафілококів, виділених від мишей

Відомо, що мікробіоценоз людини відіграє певну роль у підтриманні гомеостазу організму. У зв’язку з цим, склад та біологічна активність бактерій різних біотопів є чинниками підтримання екологічної рівноваги мікробіоценозів відкритих порожнин, серед яких і репродуктивна система.

Зараз відомо, що значну роль у формуванні дисбактеріозів відіграють умовно-патогенні мікроорганізми, які входять до складу нормофлори, але за певних умов викликають патологічні процеси. Однією з відомих груп умовно-патогенних мікроорганізмів, що входять до складу мікрофлори організму людини є факультативно анаеробні грампозитивні коки, що належать до роду Staphylococcus. Власне серед стафілококів у патології людини особливе місце належить Staphylococcus aureus, водночас значимими для людини є також S. epіdermіdіs та S. saprophyticus. Сучасні дослідження [5] дозволяють ще більш розширити спектр клінічно-значущих мікроорганізмів за рахунок коагулазонегативних стафілококів ще 9 видів, що розповсюджені у певних стаціонарах [3].

Вперше стафілококи були виділені Л. Пастером у 1880р. із гною фурункула і вивчені Ф. Розенбахом у 1884р. Основний фактор, що визначає патогенність стафілококів – це їхня здатність утворювати токсини і різноманітні ферменти. Вони утворюють різноманітні позаклітинні ферменти: плазмокоагулазу, гіалуронидазу, протеази, естерази, лізоцим, фосфатазу, ендонуклеази й ін., активно гідролізують білки, жири, твіни, розріджують желатин, відновлюють нітрати [7, 13].

Гемолізини лізують еритроцити людини і деяких тварин, справляють цитотоксичну дію на різні культури клітин. Наявність коагулази, що згортає плазму крові, є одним з найбільш важливих і постійних критеріїв патогенності стафілококів [7].

З тварин до стафілококів чутливі велика і дрібна рогата худоба, коні, свині, з експериментальних – кролики, миші, кошенята [2].

Резервуаром золотистого стафілокока служать здорові носії і хворі з різними стафілококовими хворобами. Найбільшу небезпеку в плані поширення стафілококів представляють люди, у яких патогенні стафілококи виявляються на слизовій оболонці верхніх дихальних шляхів, особливо передніх відділів носових ходів, а також люди зі шкірними хворобами [4, 12].

В зв’язку з переліченим вище метою нашої роботи було вивчити властивості стафілококів, виділених з піхви мишей, яким інтравагінально вводили додаткову кількість клітин ізолятів стафілококів, виділених від мишей.

Головними завданнями роботи було визначити наявність або відсутність гемолізинів, плазмокоагулази, ліпази та лецитинази у стафілококів та вивчити чутливість до антибіотиків виділених ізолятів.

Матеріали та методи дослідження

Із загальної сукупності самиць мишей віком 20 – 22 тижні та вагою 18 – 22 г випадковим чином відібрали необхідну для експериментів кількість тварин, яких утримували в умовах, що відповідають стандарту [6]. Всі дослідження на тваринах проводилися згідно до норм, встановлених законом України № 3447-IV “Про захист тварин від жорстокого поводження” та норм, прийнятих в Європейській конвенції по захисту хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та наукових цілей від 20.09.1985 [11].

Тваринам експериментальної групи (n=18) вводили 50 мкл суспензії добової культури клітин ізоляту S. aureus, що містила 1×10⁹ клітин/мл, тваринам контрольної групи вводили фізіологічний розчин (50 мкл).

Біологічний матеріал отримували від мишей шляхом висіву вмісту піхви на м’ясо-пептонний агар (МПА). З усіх зрослих колоній робили препарати для мікроскопії, які фарбували за методом Грама та розглядали із імерсією при збільшенні ×900. Для подальшої ідентифікації та вивчення властивостей з виділених мікроорганізмів відбирали такі колонії, мікроскопічна картина яких відповідала грампозитивним кокам. Матеріал з цих колоній пересівали на середовище Чистовича, МПА із додаванням крові (3%), на середовища Гісса із індикаторами та цукрами (глюкоза, лактоза, манітол), жовтково-сольовий агар (ЖСА) [8, 10]. Ідентифікацію вивчаємих ізолятів бактерій проводили згідно ознак, що наведені у “Определителе бактерий Берджи” [8]. Бактерії ідентифікували за наслідками вивчення морфологічних, тінкторіальних та фізіолого-біохімічних ознак культур, виділених від тварин.

Чутливість до антибіотиків отриманих від мишей ізолятів встановлювали за допомогою диск-дифузійного методу. Для проведення тесту було обрано стандартні диски з антибіотиками (фірма НИЦФ, Санкт-Петербург, Российская Федерация): пеніцилін, амоксіцилін, гентаміцин, цефтріаксон, азітроміцин, офлоксацин. Облік результатів проводили через 18 годин після розкладання дисків [1, 9].

Результати та їх обговорення

З усіх виділених ізолятів відібрали 20: по 10 ізолятів отриманих від здорових мишей і від тварин, яким інтравагінально вводили суспензію клітин золотистого стафілокока.

Здатність до гемолізу вивчали на МПА із додаванням крові (3%). Виявилося, що всі ізоляти можна поділити на 2 групи: такі, що не проявляють гемолітичних ознак, і такі, що дають β-гемоліз. Результати вивчення дозволили встановити, що гемолізини наявні у 9 ізолятів з 20, тобто у 45 % випадків.

Слід відмітити, що не спостерігалося залежності у виявленні гемолітичних властивостей серед ізолятів, отриманих від здорових тварин та мишей, яким вводили інтравагінально суспензію золотистого стафілококу.

Визначення ліпази та лецитинази проводили на ЖСА. Проводили лише якісне урахування цих ознак. За результатами дослідження встановлено, що лецитиназною активністю володіють 15 ізолятів, а ліпазою – 13 ізолятів, причому у більшості випадків (12 ізолятів) проявляються одночасно обидві активності. Також слід відмітити і те, що прояв лецитиназної та ліпазної активності спостерігався у ізолятів позитивних за наявністю гемолізинів (у 9 з 9 ізолятів, що давали гемоліз).

Вивчення наявності коагулази дозволило встановити, що серед 20 ізолятів лише 1 не мав прояву активності. Серед інших 19 ізолятів можливий умовний поділ на такі, що проявили активність на протязі першої години інкубації, другої години інкубації пробірок і такі, що проявили її при часі інкубації від 2 до 3 годин. За результатами експерименту визначено, що більшість досліджених ізолятів належать до таких, що дають позитивну відповідь протягом перших двох годин інкубації пробірок із плазмою: в період до 1 години позитивну відповідь визначено у 9 ізолятів, в період до 2 години позитивну відповідь визначено ще у 7 ізолятів, в період до 3 години – у 3 ізолятів.

Визначення чутливості до антибіотиків проводили для тих же ізолятів стафілококів, що використовували для попередніх досліджень. В результаті вивчення чутливості виділених ізолятів стафілококу до пеніциліну встановлено, що в середньому діаметр зони затримки росту становив 15,8±3,2 мм, що потрапляє до значень помірної чутливості. Однак, при розгляді кожного окремого штаму встановлено, що чутливими та помірно-чутливими до пеніциліну є більшість ізолятів (18).

В результаті вивчення чутливості виділених ізолятів стафілококу до амоксіциліну встановлено, що в середньому діаметр зони затримки росту становив 19,7±3,0 мм, що потрапляє до значень чутливості до антибіотику. При розгляді ж кожного окремого ізоляту встановлено, що чутливими до амоксіциліну є всі 20 ізолятів.

В результаті вивчення чутливості виділених ізолятів стафілококу до цефтріаксону встановлено, що в середньому діаметр зони затримки росту становив 17,1±2,9 мм, що є ознакою чутливості до антибіотику. При розгляді ж кожного окремого ізоляту встановлено, що чутливими до цефтріаксону є 20 ізолятів, а резистентних – нема.

В результаті вивчення чутливості виділених ізолятів стафілококу до азітроміцину встановлено, що в середньому діаметр зони затримки росту становив 21,0±2,3 мм, що вказує на чутливість до антибіотику. Резистентних та помірно-чутливих ізолятів серед всіх виділених від мишей не визначено, всі 20 ізолятів чутливі до препарату.

В результаті вивчення чутливості виділених ізолятів стафілококу до гентаміцину встановлено, що в середньому діаметр зони затримки росту становив 21,2±2,5 мм, що вказує на високу чутливість до дії препарата. Резистентних та помірно-чутливих ізолятів серед всіх виділених від мишей не визначено, всі 20 ізолятів чутливі до препарату.

В результаті вивчення чутливості виділених ізолятів стафілококу до офлоксацину встановлено, що в середньому діаметр зони затримки росту становив 22,3±3,5 мм, що вказує на високу чутливість до дії препарата. Резистентних та помірно-чутливих ізолятів серед всіх виділених від мишей не визначено, всі 20 ізолятів чутливі до препарату.

Висновки

1. Визначено, що 95 % досліджених ізолятів володіють плазмокоагулазною активністю, 75 % мають лецитиназу, 65  % мають ліпазу, а 60 % проявляють одночасно лецитиназну та ліпазну активність, наявність гемолізинів виявлено у 45 % ізолятів

2. Вивчення чутливості до антибіотиків показало, що ізоляти, отримані від мишей, є переважно чутливими до антибіотичних препаратів. Так, відносно амоксіциліну, цефтріаксону, азітроміцину, гентаміцину та офлоксацину не визначено резистентних форм. Відсоток резистентних до пеніциліну ізолятів склав 10 %.

Література

1. Белокрысенко С.С. Стандарты и ошибки при определении чувствительности бактерий к антимикробным препаратам диско-диффузионным методом. //Клиническая лабораторная диагностика. – 2003. – №8. – С. 49-51.

2. Вінніков А.І., Черевач Н.В., Скляр Т.В. та ін. Санітарна мікробіологія. Дніпропетровськ: Видавництво ДНУ, 2006. – 300с.

3. Волков И.И. Совершенствование микробиологической диагностики стафилококковых инфекций и экологические аспекты их возбудителей: автореф. дис. канд. мед. наук. – СПб: Б.и., 1999. – 16с.

4. Карабак В.И. Микробиологический мониторинг за возбудителями нозокомиальных инфекций (на примере отделений реанимации и интенсивной терапии) // Антибиотики и химиотерапия. – 2000. – №3. – С. 20-23.

5. Кузнецова Е.А. Микробная флора организма человека и ее роль в развитии патологических процессов М: Капитолий, 1996. – 128с.

6. Лабораторные животные: разведение, содержание, использование в эксперименте /под ред. И.П. Западнюка и соавт. – К: Вища школа, 1983. – 383с.

7. Мельников Н.И., Мельников В.Н., Гимранов М.Г. Ферменты патогенности и токсичности бактерий М.: Медицина, 1989. – 252с.

8. Определитель бактерий Берджи: Пер. с англ. /Под ред. Хоулта Дж., Криля Н., Синта П. и др. в 2-х тт. – М: Мир, 1997. – т.1 – 432с.; т.2 – 368с.

9. Поляк М.С., Авдеева М.Г., Мойсова Д.Л., Качанов А.В. Теория и практика определения чувствительности микроорганизмов к противомикробным препаратам диск-диффузионным методом (лекция) //Клиническая лабораторная диагностика. – 2003. – № 1. – С.25-32.

10. Приказ МОЗ СССР № 535 “Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений” от 22.04.1985р. – 127с.

11. Рєзніков О. Проблеми етики при проведенні експериментальних медичних і біологічних досліджень на тваринах //Вісник НАНУ. – 2001. – № 1. – С. 5-7.

12. Скуя Н.А. Внутрибольничная инфекция, принципы борьбы, профилактики, диагностики и лечения Рига: Зинатне, 1990. – 120с.

13. Хесс Р., Буданов С.В. Защитные ферменты микроорганизмов // Антибиотики и химиотерапия. – 1996. – №3. – С. 40-44.