Биологические науки/9. Биохимия и биофизика

Абрат О.Б.

Прикарпатський національний університет ім. В. Стефаника, Україна

Механізми захисту дріжджів Saccharomyces cerevisiae від стресу під впливом оцтової та пропіонової кислот

Оцтова і пропіонова кислоти – поширені компонентами середовищ, де ростуть мікроорганізми. Водночас є достатньо інформації щодо антимікробного впливу цих кислот, що зумовлює їх широке використання при консервуванні харчових продуктів і напоїв [1]. Для оптимізації технології консервування необхідно з одного боку, з’ясувати механізми впливу складових консервантів на клітини, а, з іншого, до кінця зрозуміти механізми стійкості до них мікроорганізмів і розробити заходи для обмеження її виникнення і поширення. Нами досліджено роль транспортної та антиоксидантної систем як можливих механізмів, які беруть участь у забезпеченні захисту дріжджів Sacchromyces cerеvisiae від стресу, спричиненого оцтовою та пропіоновою кислотами.

У дослідженнях використовували наступні штами S. cerevisiae: W303-1A – дикий тип та його ізогенні похідні ΔPDR12 і ΔWAR1, які дефектні за генами білка Pdr12 і його транскрипційного фактора War1 відповідно; а також інший дикий штам YPH250 та його дочірні штами ΔSOD1ΔSOD2, дефектний за цитозольною та мітохондріальною СОД; ΔCTA1ΔCTT1, дефектний за цитозольною та пероксисомною каталазами; ΔYAP1, дефектний за регуляторним білком Yap1. Життєздатність клітин оцінювали за кількістю колонієутворюючих одиниць після висіву клітинної суспензії на чашки Петрі. Швидкість виходу флуоресцеїну з клітин та активність антиоксидантних ферментів визначали відповідно флуоресцентним та спектрофотометричним методами.

Транспортний білок Pdr12 є одним з найважливіших компонентів системи захисту дріжджів S. cerevisiae від дії слабких органічних кислот (СОК) [2]. Він забезпечує виведення останніх з клітини. Вважається, що органічна кислота флуоресцеїн також може транспортуватись білком Pdr12 в присутності глюкози. Транспортування флуоресцеїну часто використовують як модельну систему для дослідження механізмів виведення аніонів СОК з клітин дріжджів за участю білка Pdr12 [2]. Нами показано, що оцтова кислота за різних концентрацій призводила до інгібування швидкості виходу флуоресцеїну з клітин S. cerevisiae. Припускаємо, що оцтова кислота конкурує з внутрішньоклітинним флуоресцеїном за компоненти, що транспортують його з клітин. При цьому константа половинного інгібування виходу флуоресцеїну з клітин дикого штаму W303-1A була у три рази нижчою, порівняно з дочірніми штамами ΔPDR12 та ΔWAR1. Ймовірно, аніони оцтової кислоти, інгібуючи вихід флуоресцеїну, можуть потенційно транспортуватись Pdr12. Пропіонова кислота також інгібувала вихід флуоресцеїну з клітин дріжджів. Проте, на відміну від оцтової, при наявності пропіонової кислоти дефіцит транспортного білка Pdr12 або його транскрипційного фактору War1 не впливав на константи інгібування виходу флуоресцеїну. Отже, присутність транспортного білка Pdr12 збільшує спорідненість системи, що відповідає за транспортування флуоресцеїну, до оцтової кислоти, але не впливає на спорідненість до пропіонової кислоти.

Для порівняння чутливості дріжджів до оцтової та пропіонової кислот оцінювали їх виживання під дією стресу, спричиненого цими кислотами різних концентрацій. Оцтова та пропіонова кислоти знижували виживання дріжджів дикого W303-1A та обох його дочірніх штамів. Чутливість мутантних штамів ΔPDR12 і ΔWAR1 до оцтової та пропіонової кислот була різною. Толерантність цих штамів до пропіонової кислоти, в порівнянні з оцтовою, була нижчою при їхній дії в концентраціях до 100 мМ. Поясненням такого ефекту може бути різниця в метаболізмі цих двох кислот. В той же час, стійкість мутантних штамів до пропіонової кислоти в концентрації 200 мМ навпаки була вищою, порівняно з оцтовою кислотою. У цьому випадку важливе місце може посідати відмінність у механізмах впливу цих кислот на клітину.

Оскільки токсичний вплив СОК часто супроводжується генерацією супероксид-аніону та пероксиду водню в клітинах [3], то не менш важливою проблемою було дослідження участі СОД та каталази, як ферментів першої ланки антиоксидантного захисту, у відповіді S. cerevisiae на кислотний стрес. Нами показано, що оцтова кислота в концентрації 200 мМ призводила до достовірного зростання активностей СОД і каталази у клітинах дріжджів усіх досліджуваних штамів. При цьому активність ферментів поступово зростала зі збільшенням часу дії кислоти. Ймовірно обидва досліджувані ферменти беруть участь у відповіді клітин S. cerevisiae на стрес, індукований оцтовою кислотою. Разом з тим, вплив ацетату на клітини дріжджів супроводжувався збільшенням вмісту карбонільних груп білків у них. Це може свідчити про участь оцтової кислоти в порушенні редокс-балансу в клітинах дріжджів та розвитку оксидативного стресу. Пропіонова кислота в різних концентраціях призводила до зниження виживання клітин дріжджів. Проте змін у вмісті карбонільних груп білків та активності антиоксидантних ферментів до, і після індукції стресу, не спостерігали. Напевно механізм дії пропіонової кислоти не пов’язаний з індукцією оксидативного стресу в клітинах S. cerevisiae.

Для дослідження можливих механізмів, які забезпечують зростання активностей СОД і каталази за дії оцтової кислоти, клітини дріжджів попередньо обробляли циклогексимідом – інгібітор синтезу білка в еукаріотів. Показано, що в присутності циклогексиміду активність СОД у відповідь на інкубування дріжджів за низьких значень рН чи дії 200 мМ оцтової кислоти не змінювалася, а активність каталази зростала, подібно до експериментів без циклогексиміду. Можливо відповідь S. cerevisiae на дію оцтової кислоти пов’язана із синтезом нових молекул СОД, тоді як зростання активності каталази відбувається за рахунок активації наявних неактивних молекул цього ферменту. На користь цього припущення свідчить той факт, що інактивація генів, які кодують цитозольну і пероксисомну каталази в штаму ΔСTA1ΔCTT1 не змінювала чутливості дріжджів до 200 мМ оцтової кислоти, порівняно з батьківським штамом YPH250. Натомість інактивація генів цитозольної і мітохондріальної СОД (штам ΔSOD1ΔSOD2) та регуляторного білка Yap1 (штам ΔYAP1) істотно знижувала виживання дріжджів за цих умов. Водночас 150–200 мМ оцтова кислота призводила до зростання активності каталази в клітинах штаму ΔYAP1 подібно до його батьківського штаму YPH250, тоді як змін в активності СОД за цих же умов не було. Можна припустити, що Yap1 бере участь у відповіді клітин на кислотний стрес через експресію деяких генів антиоксидантної системи, зокрема СОД.

Підсумовуючи отримані дані, можна дійти висновку, що участь транспортних білків мембран та антиоксидантної системи у забезпеченні захисту клітин S. cerevisiae від дії оцтової та пропіонової кислот є різною. Такий ефект, ймовірно, пов’язаний із різницею в механізмах впливу цих кислот на клітини.

Литература:

1. Brul S., Coote P. Preservative agents in foods // Food Microbiol. – 1999. – Vol. 50. – P. 1–17.

2. Guaragnella N., Antonacci L., Passarella S. et al. Hydrogen peroxide and superoxide anion production during acetic acid-induced yeast programmed cell death // Folia Micribiol. – 2007. – Vol. 52, N 3. – P. 237–340.

3. Holyoak C.D., Bracey D., Piper P.W. et al. The Saccharomyces cerevisiae weak-acid inducible ABC transporter Pdr12 transports fluorescein and preservative anions from the cytosol by an energy-dependent mechanism // J. Bacteriol. – 1999. – Vol. 181, N 15 – P. 4644–4652.